Biorredução de Bis-Chalconas

Cinco bis-chalconas foram sintetizadas com diferentes ligantes (-H, -2,5-OCH₃, -2-C₆H₅, -3,4-OCH₂O) utilizando-se a reação de condensação de Claisen-Schmidt. Duas rotas sintéticas foram empregadas, a primeira utilizando 2 mmol de benzaldeídos substituídos e 1 mmol de 1,4-diacetilbenzeno em meio alcoólico (EtOH) com KOH como catalisador. A segunda rota utilizou 2 mmol de acetofenonas substituídas e 1 mmol de tereftaldeído nas mesmas condições reacionais do primeiro método. O rendimento das sínteses iniciais foi considerado alto, acima de 84%. É importante notar a menção à baixa quantidade de 1,4-diacetilbenzeno disponível, limitando a síntese de apenas uma das séries de bis-chalconas. A coloração amarela das bis-chalconas foi observada, com variações de tonalidade dependendo da presença ou ausência de substituintes. Um ponto crucial destacado é a baixa solubilidade das bis-chalconas em diversos solventes orgânicos (metanol, etanol, clorofórmio, diclorometano, DMSO, n-hexano, acetato de etila e acetona), sendo que a bis-chalcona 8d (-3,4-OCH₂O-) se mostrou insolúvel em todos os solventes testados, o que representou um desafio para os procedimentos subsequentes.

A caracterização das bis-chalconas sintetizadas e seus respectivos produtos de redução foi realizada empregando-se técnicas espectroscópicas. A ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de ¹H), utilizando aparelhos de 400 MHz e 200 MHz disponíveis na Central de Análises da UFSC, forneceu informações estruturais importantes. A análise dos espectros de RMN de ¹H permitiu a identificação de dois dubletos característicos dos prótons Hα e Hβ das bis-chalconas, confirmando a formação dos produtos. Os compostos 5a e 8a foram utilizados como exemplos representativos para suas respectivas séries, assim como seus álcoois correspondentes obtidos após redução com NaBH₄. A caracterização dos álcoois resultantes da redução mostrou-se eficiente pela quebra da ligação dupla C=O, com adição de novas ligações C-H e O-H. Observações espectroscópicas, como a do Hα deslocado para direita (~1 ppm), e a sobreposição dos sinais com hidrogênios aromáticos, gerando dificuldades na identificação individual de sinais, foram registradas e analisadas. Além da RMN de ¹H, a espectroscopia de infravermelho (IV) foi utilizada na caracterização das bis-chalconas. A bis-chalcona 8b serviu de exemplo para a análise de espectros de IV, com a identificação de bandas características dos anéis aromáticos, grupos metóxi e o grupo carbonila de uma cetona α,β-insaturada. Uma tabela com valores de número de onda para as bandas características das bis-chalconas, baseada em dados da literatura, foi utilizada para a interpretação dos espectros de IV. A constante de acoplamento J entre os Hα e Hβ também foi analisada, sendo que o valor de J = 16 Hz é característico de chalconas com isomeria E.

A pesquisa utilizou Saccharomyces cerevisiae (fermento de pão, FP), como biocatalisador para a biorredução das bis-chalconas. A escolha se justifica pela capacidade da levedura em reduzir ligações duplas em compostos carbonílicos α,β-insaturados, como as chalconas, de forma quimiosseletiva. A utilização de S. cerevisiae como biocatalisador oferece vantagens em relação a métodos químicos tradicionais, que frequentemente envolvem catalisadores metálicos tóxicos e de alto custo. A atividade catalítica das enzimas em S. cerevisiae pode ser controlada através da manipulação de parâmetros como temperatura, concentração de substratos e pH, permitindo maior controle da reação e seletividade. O documento menciona o uso de células íntegras de S. cerevisiae, evitando a necessidade de extração e purificação de enzimas específicas, o que reduz custos e simplifica o processo. A utilização de células íntegras é uma alternativa viável e de baixo custo para a redução de compostos carbonílicos α,β-insaturados.

Diferentes sistemas de reação foram testados para otimizar a biorredução das bis-chalconas utilizando S. cerevisiae. Inicialmente, um sistema bifásico, semelhante aos desenvolvidos em trabalhos anteriores do grupo, foi empregado. Este sistema consistia em uma fase aquosa (contendo o fermento) e uma fase orgânica (contendo o substrato). No entanto, a formação de emulsão entre as fases representou um problema significativo, dificultando a extração do produto. Para superar essa dificuldade, o biocatalisador foi imobilizado em microesferas de alginato de cálcio, buscando melhorar a eficiência da reação e minimizar a formação de emulsão. Em seguida, utilizou-se um sistema monofásico, com a adição de co-solventes (DMSO e CH₂Cl₂) para aumentar a solubilidade das bis-chalconas. O sistema monofásico também apresentou desafios, como a aglutinação do FP após agitação na fase de n-hexano e a dificuldade na separação do produto devido à presença de DMSO. Em uma outra abordagem, para a reação em sistema monofásico, a bis-chalcona foi imobilizada em papel filtro antes da adição do fermento de pão e dos solventes (n-hexano e DMSO). O uso de borohidreto de sódio (NaBH4) foi usado em paralelo como método de redução química para comparação.

A imobilização de S. cerevisiae em microesferas de alginato de cálcio foi uma estratégia empregada para otimizar a biorredução. O alginato de cálcio foi escolhido devido ao seu baixo custo, alta afinidade com água, capacidade de formar géis estáveis em condições amenas, além de ser atóxico e não-patogênico. O alginato, um polissacarídeo derivado de algas marinhas, forma um gel estável quando o cátion monovalente Na⁺ é substituído por um cátion divalente Ca²⁺. A preparação das microesferas envolveu duas soluções: uma solução de alginato de sódio (2%) e uma solução de cloreto de cálcio (2%). A formação das microesferas foi realizada utilizando uma seringa com uma agulha curvada acoplada a uma bomba peristáltica, garantindo um volume controlado (60 μL). A microscopia das esferas permitiu a observação do diâmetro médio (2,5 mm) e a confirmação da distribuição do fermento tanto na superfície quanto no interior das microesferas. A utilização de microesferas de menor volume visava aumentar a área superficial das mesmas para maximizar a interação com o substrato e, consequentemente, a atividade catalítica.

O sistema bifásico (n-hexano/tampão fosfato de potássio, pH 6) apresentou baixa conversão, atribuída à baixa solubilidade da bis-chalcona 8a em n-hexano e à formação de emulsão durante a extração. Consequentemente, a interação entre o fermento na fase aquosa e o substrato na fase orgânica foi limitada. Como alternativa, foram testados sistemas monofásicos utilizando co-solventes (DMSO e diclorometano), buscando aumentar a solubilidade do substrato. Embora o sistema monofásico com DMSO tenha mostrado alguma redução, parte do DMSO contaminou o produto após a extração, dificultando sua caracterização por RMN de ¹H e IV. A utilização de diclorometano como co-solvente inibiu completamente a atividade do fermento, demonstrando sua toxicidade para S. cerevisiae. A bis-chalcona 8a foi escolhida para otimização devido à sua ausência de substituintes e maior disponibilidade. A análise por RMN de ¹H indicou a presença de dois tripletos na região de 3,0-3,3 ppm como indicadores de redução da ligação dupla C=C, sendo que a persistência do dubleto característico das bis-chalconas (J = 16 Hz) indicava redução incompleta do substrato.

A caracterização dos produtos de biorredução foi realizada por RMN de ¹H e espectroscopia de IV. A RMN de ¹H mostrou o surgimento de dois tripletos na região de 3,0-3,3 ppm, indicando a redução da dupla ligação C=C. A constante de acoplamento J entre os prótons Hα e Hβ foi utilizada para avaliar a extensão da reação, onde a manutenção do valor de 16 Hz indicava a presença de substrato não-reduzido. A espectroscopia de IV, exemplificada pela bis-chalcona 8b, confirmou a presença de bandas características de anéis aromáticos e grupos metóxi. A banda em 1696 cm⁻¹ indicou a presença do grupo carbonila de uma cetona α,β-insaturada. A comparação entre os espectros de RMN de ¹H de reações com DMSO e diclorometano evidenciou a ineficiência da biorredução na presença de solventes clorados. O espectro de IV da bis-chalcona 8a biorreduzida em sistema monofásico com n-hexano e DMSO, utilizando o fermento imobilizado em papel filtro, mostrou a redução parcial da ligação C=C. A metodologia de imobilização da bis-chalcona em papel filtro não foi efetiva em aumentar a conversão da reação.

A imobilização do fermento de pão em microesferas de alginato de cálcio foi realizada com o objetivo de melhorar a eficiência da biorredução. Foram preparados dois tipos de microesferas: uma com volumes variados (feitos manualmente com pipeta Pasteur) e outra com volume controlado (60 μL), utilizando uma bomba peristáltica. A microscopia das microesferas com volume controlado (diâmetro médio de 2,5 mm) confirmou a presença do fermento espalhado na superfície e no interior das esferas. A biorredução da bis-chalcona 8a utilizando o fermento imobilizado em microesferas de alginato de cálcio, em sistema monofásico com n-hexano e DMSO, mostrou redução parcial e seletiva na ligação C=C, conforme evidenciado pela espectroscopia de IV. A presença de trealose nas microesferas foi usada para proteger o fermento. Os resultados obtidos sugerem que a baixa solubilidade dos substratos foi o principal fator limitante da eficiência da biorredução, abrindo caminho para futuros estudos com variações de temperatura, tempo de reação, massa do biocatalisador, grupos substituintes e nível de reticulação das microesferas.