Biossensor para Detecção de Rutina

O trabalho centraliza-se na construção de um biossensor inovador para a determinação precisa de rutina em amostras de origem farmacêutica. Este biossensor de pasta de carbono apresenta uma composição única: nanopartículas de ouro (AuNP), estabilizadas com β-ciclodextrina (β-CD) e imobilizadas com a enzima lacase (LAC). A escolha da lacase como bioelemento se justifica pela sua reconhecida capacidade catalítica na oxidação de compostos fenólicos, grupo ao qual pertence a rutina. A síntese das AuNP foi realizada utilizando-se borohidreto de sódio como agente redutor, enquanto a β-CD atuou como agente estabilizante, prevenindo a agregação das nanopartículas. A lacase utilizada, Denilite® II BASE, foi fornecida pela Novozymes e produzida a partir de Aspergillus oryzae geneticamente modificado. Após a síntese e imobilização, o biossensor foi minuciosamente caracterizado através de diversas técnicas, incluindo microscopia eletrônica de transmissão (TEM), medidas espectrofotométricas e análises de potencial zeta, garantindo a eficácia do processo de construção. O método de construção do biossensor inclui a mistura de AuNP-CD-LAC com grafite em pó e Nujol, sendo posteriormente transferido para uma seringa de plástico contendo um fio de cobre para contato elétrico. A otimização das condições experimentais, que inclui a escolha do tampão acetato (0,1 mol L⁻¹, pH 5,0), o volume de AuNP-CD-LAC (50 µL) e a concentração de lacase (1,145 U mL⁻¹), foi crucial para atingir a melhor resposta analítica na voltametria de onda quadrada (SWV).

Após a construção, o biossensor foi submetido a um rigoroso processo de otimização e caracterização. A atividade enzimática da lacase, tanto na sua forma livre quanto imobilizada, foi determinada por espectrofotometria UV-Vis, utilizando o substrato ABTS. A imobilização da lacase nas AuNP-β-CD resultou em um aumento da atividade enzimática, comprovando a eficácia do processo de imobilização. Um estudo de impedância eletroquímica foi conduzido para avaliar a resistência à transferência de carga (Rct) na superfície dos eletrodos modificados, utilizando o sistema [Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻. A otimização dos parâmetros do método eletroquímico, conduzida através da voltametria de onda quadrada (SWV), focou em determinar as condições ideais para a obtenção do melhor sinal analítico. Foram otimizados o pH do tampão (acetato 0,1 mol L⁻¹), a concentração de lacase e o volume de AuNP-β-CD-LAC. A melhor resposta analítica foi obtida em tampão acetato (0,1 mol L⁻¹, pH 5,0), utilizando 50 µL de AuNP-CD-LAC e 1,145 U mL⁻¹ de lacase, com amplitude de 40 mV, frequência de 100 Hz e incremento de 10 mV.

Com as condições otimizadas, foi construída a curva de calibração para rutina utilizando a voltametria de onda quadrada (SWV). A curva apresentou dois perfis lineares distintos, com limites de detecção (LOD) de 1,73 x 10⁻⁷ mol L⁻¹ (primeira faixa) e 5,85 x 10⁻⁷ mol L⁻¹ (segunda faixa), demonstrando a alta sensibilidade do biossensor. A seletividade do biossensor foi avaliada através de um estudo de interferentes, utilizando os excipientes presentes nas amostras de rutina (creme e cápsulas). Os resultados demonstraram que os excipientes não interferiram na determinação de rutina pelo método eletroquímico proposto, comprovando a seletividade do biossensor desenvolvido. Os limites de quantificação (LOQ) também foram calculados para ambas as faixas lineares.

A avaliação do desempenho do biossensor incluiu estudos de repetibilidade e reprodutibilidade, utilizando o mesmo biossensor e biossensores diferentes, respectivamente. Os resultados mostraram desvios padrão relativos (RSD) menores que 6%, indicando boa repetibilidade e reprodutibilidade. A estabilidade do biossensor foi avaliada durante 180 dias em temperatura ambiente, apresentando um RSD inferior a 2,4%, demonstrando excelente estabilidade a longo prazo. A alta estabilidade observada foi atribuída à eficiência na imobilização da enzima no nanomaterial, mantendo a atividade catalítica da lacase. Finalmente, a aplicabilidade do biossensor foi testada na determinação de rutina em amostras farmacêuticas reais (cremes e cápsulas). Os resultados obtidos mostraram boa concordância com os valores rotulados e com os resultados obtidos por um método de referência, confirmando a precisão e a aplicabilidade do biossensor para análises em amostras reais.

A síntese das nanopartículas de ouro (AuNP) funcionalizadas com β-ciclodextrina (β-CD) constitui a etapa inicial crucial deste trabalho. O método empregado envolveu a redução de cloreto de ouro (III) tri-hidratado (HAuCl₄), obtido da Sigma-Aldrich, utilizando borohidreto de sódio (20 mmol L⁻¹, Nuclear) como agente redutor. A β-ciclodextrina (0,5% m/v, Sigma-Aldrich) desempenhou um papel fundamental como agente estabilizante, prevenindo a aglomeração das nanopartículas de ouro recém-formadas. O processo foi realizado sob agitação, resultando numa mudança de cor visível na solução, de amarela para vermelha, que indica a formação bem-sucedida das AuNP-β-CD. Essa alteração na coloração é uma característica típica da formação de nanopartículas de ouro. A concentração utilizada de HAuCl₄ foi de 0,1 mol L⁻¹. A síntese, portanto, foi uma reação de redução química simples, mas que requereu controle cuidadoso das condições reacionais. Os reagentes utilizados são facilmente encontráveis comercialmente.

Após a síntese das AuNP-β-CD, a etapa subsequente consistiu na imobilização da enzima lacase (LAC). A lacase empregada foi a Denilite® II BASE, uma enzima produzida pela Novozymes (Dinamarca) a partir de Aspergillus oryzae geneticamente modificado. A atividade enzimática da lacase foi determinada previamente por espectrofotometria UV-Vis, monitorando a oxidação do substrato ABTS (sal de amônio do ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico)) a 420 nm. Esta análise foi crucial para determinar a atividade enzimática inicial da lacase antes e após o processo de imobilização. A solução de lacase foi então misturada à dispersão de AuNP-β-CD, realizando a imobilização da enzima no nanomaterial, formando o complexo AuNP-β-CD-LAC. O sucesso da imobilização foi confirmado comparando-se a atividade enzimática da lacase livre e imobilizada, utilizando-se um fator de diluição diferente para cada caso. Um aumento da atividade enzimática após a imobilização indicou a eficiência do processo e a ausência de desnaturação da enzima. A metodologia de imobilização garante uma melhor estabilidade e reutilização da enzima.

A caracterização completa dos nanomateriais sintetizados (AuNP-β-CD e AuNP-β-CD-LAC) foi essencial para validar o processo de síntese e imobilização. As técnicas empregadas incluíram microscopia eletrônica de transmissão (TEM), espectrofotometria UV-Vis e medidas de potencial zeta. A microscopia eletrônica de transmissão permitiu a visualização direta das nanopartículas, fornecendo informações sobre o tamanho e a morfologia das AuNP, tanto na sua forma pura quanto após a imobilização da lacase. A espectrofotometria UV-Vis contribuiu para a caracterização, possibilitando a avaliação da formação das nanopartículas de ouro e a monitorização das interações entre a β-ciclodextrina e a lacase. As medidas de potencial zeta forneceram informações sobre a carga superficial dos nanomateriais, o que é importante para entender as interações com a lacase e a estabilidade da dispersão. A análise das imagens de TEM permitiu a determinação do tamanho médio das nanopartículas de AuNP-β-CD em aproximadamente 24,3 nm. O tamanho das AuNP-β-CD-LAC aumentou em relação às AuNP-β-CD, devido à interação com as moléculas aniônicas da lacase (pI < 4) na superfície positiva das AuNP-β-CD em pH próximo a 6.0. As medidas de potencial Zeta corroboraram essa análise, mostrando um potencial de +17,7 mV para AuNP-β-CD e -29,5 mV para AuNP-β-CD-LAC.

A otimização das condições experimentais foi crucial para o sucesso do biossensor. Inicialmente, o pH e o tipo de tampão foram investigados para determinar as condições ótimas para a detecção de rutina. Foram testados tampões acetato e fosfato, ambos a 0,1 mol L⁻¹, em diferentes faixas de pH. Utilizando a técnica de voltametria de onda quadrada (SWV) com uma solução de rutina 3,0 x 10⁻⁴ mol L⁻¹, os resultados mostraram que a máxima corrente para a rutina foi obtida em tampão acetato 0,1 mol L⁻¹ com pH 5,0. Essa condição foi selecionada como a ideal para os estudos subsequentes, garantindo a melhor resposta analítica do biossensor. A escolha do tampão e do pH influenciam diretamente a atividade enzimática da lacase e a transferência de elétrons, aspectos críticos para o funcionamento do biossensor. A otimização do pH garante a máxima atividade enzimática e eficiência na detecção do analito, enquanto o tampão garante um ambiente eletroquímico estável.

Após a otimização do tampão e do pH, a concentração de lacase (LAC) e o volume de AuNP-CD-LAC foram investigados para determinar as condições que maximizam a resposta do biossensor. Variando a concentração de lacase, observou-se um aumento na corrente resultante para a rutina até um ponto ótimo de 1,145 unidades de LAC por eletrodo. Acima desse valor, a corrente exibiu uma ligeira diminuição, possivelmente devido ao aumento da resistência à transferência de elétrons. Similarmente, o volume de AuNP-CD-LAC foi otimizado, observando-se que 50 µL forneceu a melhor resposta analítica. Assim, 1,145 unidades de LAC por eletrodo e 50 µL de AuNP-CD-LAC foram as condições selecionadas para a construção dos biossensores. Essa otimização garante a melhor relação entre sensibilidade e ruído do sinal, maximizando a precisão e a confiabilidade das medições.

Com as condições otimizadas (tampão acetato 0,1 mol L⁻¹ pH 5,0; 50 µL de AuNP-CD-LAC; 1,145 U mL⁻¹ de lacase; e parâmetros da SWV definidos), a curva de calibração para rutina foi construída utilizando-se voltametria de onda quadrada (SWV). Os resultados revelaram duas faixas lineares distintas. A primeira faixa linear (I) estendeu-se de 3,0 x 10⁻⁷ a 1,5 x 10⁻⁶ mol L⁻¹ (r² = 0,9949), com um limite de detecção (LOD) de 1,73 x 10⁻⁷ mol L⁻¹. A segunda faixa linear (II) variou de 2,10 x 10⁻⁶ a 5,0 x 10⁻⁶ mol L⁻¹ (r² = 0,9944), com LOD de 5,85 x 10⁻⁷ mol L⁻¹. Os limites de quantificação (LOQ) também foram calculados para ambas as faixas. Os coeficientes de correlação (r²) próximos a 1 indicam um alto grau de linearidade nas duas faixas, demonstrando a precisão e a confiabilidade do biossensor para a determinação quantitativa da rutina numa ampla faixa de concentrações.

Para avaliar a confiabilidade do biossensor proposto, estudos de repetibilidade e reprodutibilidade foram realizados. A repetibilidade foi avaliada utilizando o mesmo biossensor para sete medidas consecutivas de SWV, a uma concentração de rutina de 3 x 10⁻⁶ mol L⁻¹ em tampão acetato (0,1 mol L⁻¹, pH 5,0). O desvio padrão relativo (RSD) obtido para as correntes de pico foi de 5,6%, indicando boa repetibilidade. A reprodutibilidade, por sua vez, foi avaliada utilizando três biossensores construídos de forma idêntica. O RSD entre as medidas realizadas com cada eletrodo foi de 6,0%, demonstrando também boa reprodutibilidade. Esses resultados comprovam a consistência e a confiabilidade do método de construção do biossensor e a sua capacidade de gerar resultados reprodutíveis em diferentes experimentos e biossensores.

A estabilidade do biossensor foi investigada utilizando a técnica de SWV com uma concentração de rutina de 8,97 x 10⁻⁷ mol L⁻¹ durante um período de 180 dias. O biossensor foi mantido em temperatura ambiente (aproximadamente 25°C). O RSD entre as medidas realizadas ao longo desse período foi inferior a 2,4%, demonstrando excelente estabilidade. Este resultado indica a alta eficiência do processo de imobilização da enzima lacase no nanomaterial, que preserva a atividade catalítica da enzima por um período prolongado. A longa estabilidade do biossensor é um fator crucial para sua aplicabilidade prática, pois garante a sua viabilidade para uso em análises repetidas sem a necessidade de substituição frequente.

A aplicabilidade do biossensor foi avaliada na determinação de rutina em amostras farmacêuticas reais, incluindo cremes e cápsulas. Os resultados obtidos mostraram-se em concordância com os valores rotulados e com os resultados de um método de referência, demonstrando a exatidão do método proposto. A alta sensibilidade do biossensor, evidenciada pelo baixo limite de detecção (LOD de 1,73 x 10⁻⁷ mol L⁻¹ para a primeira faixa linear), permitiu a quantificação precisa da rutina mesmo em baixas concentrações. As recuperações obtidas para as amostras reais variaram entre 96,2% e 103,8%, confirmando a ausência de efeitos de matriz significativos e a capacidade do biossensor de fornecer resultados precisos e confiáveis em aplicações práticas. O uso de um método eletroquímico, como o proposto, oferece vantagens sobre outras técnicas por seu baixo custo e simplicidade.