Biossensor para Dopamina

Esta seção define o biossensor como um dispositivo que combina material biológico (um receptor biológico) com um transdutor, fornecendo informação analítica quantitativa de um analito. A interação do receptor biológico com o analito específico causa uma transformação físico-química, que pode ser luminescência, transferência de elétrons ou variação de massa, gerando um sinal mensurável. No trabalho, o transdutor é eletroquímico, especificamente amperométrico, medindo a corrente gerada. A escolha pela amperometria justifica-se pela resposta em forma de corrente, facilitando a análise. A adição de enzimas como modificadoras aumenta a seletividade e a sensibilidade do eletrodo, crucial em medidas eletroquímicas onde moléculas com potenciais redox próximos podem interferir na determinação da concentração do analito. A utilização de enzimas, surfactantes e nanomateriais é destacada como forma de aumentar a sensibilidade e seletividade do método.

A revisão discute as propriedades e o papel dos surfactantes na construção do biossensor. Os surfactantes são moléculas anfifilicas, com uma parte polar (“cabeça”) e uma parte apolar (“cauda”), buscando interfaces onde podem interagir com ambas as fases. Essa característica confere novas propriedades interfaciais ao sistema. Quando adicionados à água, por exemplo, reduzem a tensão superficial, distribuindo-se na superfície água/ar com a “cabeça” voltada para a água e a “cauda” para o ar. Após saturar a interface ar/água, a adição de mais surfactante leva à formação de micelas, com a concentração micelar crítica (CMC) dependendo tanto do efeito hidrofóbico da “cauda” quanto do efeito hidrofílico da “cabeça”. Surfactantes com a mesma “cabeça” terão CMCs diferenciadas apenas pelo tamanho da “cauda”, sendo menor a CMC quanto maior o efeito hidrofílico. No contexto do biossensor, os surfactantes auxiliam no transporte de elétrons e acesso do analito à superfície do eletrodo.

A seção detalha a importância da dopamina e a necessidade de sua determinação precisa. A dopamina, 2-(3,4-dihidroxifenil)etilamina, é um neurotransmissor crucial no corpo humano, com papel fundamental no sistema nervoso central, renal e hormonal. Sua determinação é importante tanto em fármacos quanto em fluidos biológicos, pois seu metabolismo anormal está associado a doenças neurológicas como epilepsia, demência senil, mal de Parkinson, esquizofrenia e mal de Alzheimer. O tratamento dessas condições frequentemente envolve medicamentos contendo dopamina, reforçando a necessidade de métodos precisos para quantificação. A dopamina também está disponível em medicamentos intravenosos, afetando o sistema nervoso simpático com aumento dos batimentos cardíacos e da pressão sanguínea. A determinação precisa de dopamina, portanto, é vital para diagnóstico e tratamento.

A voltametria é apresentada como a técnica eletroanalítica empregada para a determinação de dopamina no biossensor. A técnica estuda a relação entre potencial, corrente e tempo durante a eletrólise em uma célula eletroquímica, baseando-se na variação de potencial e na medida da corrente gerada pela oxidação/redução de compostos em solução. Utiliza-se uma cela eletroquímica com três eletrodos: referência, trabalho e auxiliar (contra eletrodo). A corrente não flui pelo eletrodo de referência para evitar a eletrólise da solução interna e a perda da sua função. Diversas técnicas voltamétricas existem, classificadas em lineares (variação de potencial linear com o tempo) e pulsadas (variação de potencial em pulsos, com medida da corrente ao final de cada pulso). As técnicas pulsadas, como a voltametria de pulso diferencial (VPD) e a voltametria de onda quadrada (VOQ), minimizam a corrente capacitiva indesejada, associada ao carregamento da dupla camada elétrica e não diretamente à concentração do analito. A corrente faradaica, proveniente dos processos redox, é a que se relaciona com a concentração do analito.

A metodologia inicia descrevendo a preparação dos reagentes e soluções. Todos os reagentes utilizados são de grau analítico, sem necessidade de purificação adicional. As soluções foram preparadas utilizando água deionizada para evitar erros causados por contaminantes. Soluções tampão acetato 0,1 mol L⁻¹ foram preparadas a partir da adição de acetato de sódio e ácido acético 0,1 mol L⁻¹ (Sigma-Aldrich), com ajuste de pH utilizando ácido acético concentrado ou hidróxido de sódio, conforme necessário. Soluções tampão fosfato 0,1 mol L⁻¹ foram preparadas com sais de fosfato (dihidrogenofosfato e monohidrogenofosfato - Vetec), com ajuste de pH usando ácido fosfórico (Nuclear) ou hidróxido de sódio (Sigma-Aldrich). A escolha da água deionizada para preparo das soluções visa minimizar interferências em análises posteriores, garantindo a qualidade dos resultados. A padronização dos reagentes é fundamental para a confiabilidade dos dados obtidos no experimento.

A atividade enzimática da lacase foi determinada utilizando um espectrofotômetro UV-Vis, monitorando a oxidação do substrato ABTS (2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), Sigma-Aldrich) a 420 nm. A atividade foi medida adicionando 0,2 mL da solução de lacase a 2,8 mL de ABTS, acompanhando a absorbância a cada 10 segundos por 3 minutos. O experimento foi realizado em triplicata, e a atividade enzimática calculada em unidades por mL (U mL⁻¹). Após a determinação da atividade, a enzima lacase foi imobilizada em haloisita nanométrica (nanotubos de haloisita, HNT, Sigma-Aldrich) via adsorção física. Este processo consistiu em adicionar 10 µL de lacase (0,05 U mL⁻¹) a 20 mg de HNT, homogeneizando e secando a mistura a vácuo por 1 hora. A imobilização da enzima é crucial para garantir a estabilidade e a atividade catalítica da lacase durante a utilização do biossensor, minimizando a desnaturalização e perda de sua atividade enzimática.

Quatro surfactantes foram sintetizados e caracterizados pelo Laboratório de Catálise de Fenômenos Interfaciais (LACFI/INCT-catálise) e cedidos ao Laboratório de Biossensores (LaBios) para a construção e testes dos biossensores. Os surfactantes, 3-(1-decil-3-imidazólio) propanosulfonato (ImS3-10), 3-(1-dodecil-3-imidazólio) propanosulfonato (ImS3-12), 3-(1-tetradecil-3-imidazólio) propanosulfonato (ImS3-14) e 3-(1-hexadecil-3-imidazólio) propanosulfonato (ImS3-16), foram avaliados por espectroscopia de impedância eletroquímica. Foram construídos quatro sensores (EPC), cada um contendo um dos surfactantes. O surfactante que apresentou a menor resistência à passagem de corrente e a menor capacitância foi selecionado para o desenvolvimento do trabalho. A utilização da espectroscopia de impedância é uma técnica eletroquímica que permite determinar a resistência e a capacitância dos eletrodos, sendo essencial para a seleção do melhor surfactante que otimiza o desempenho do biossensor.

A amostra de dopamina utilizada foi obtida comercialmente e armazenada em baixa temperatura para evitar degradação. Para análise, a amostra foi diluída a uma concentração adequada para o estudo, próxima da concentração da solução padrão de dopamina. A metodologia de preparo da amostra para análise é um fator crucial para a obtenção de resultados confiáveis. O armazenamento em baixa temperatura visa evitar a degradação do analito, preservando sua concentração original e garantindo a precisão da análise. A diluição da amostra deve ser feita para garantir a concentração esteja dentro da faixa de linearidade da curva de calibração, evitando erros de medição causados pela saturação do sensor ou por respostas fora da região linear.

Esta seção descreve o princípio de funcionamento do biossensor desenvolvido. A Figura 4 ilustra o eletrodo de pasta de carbono (EPC) modificado com o surfactante ImS3-14 e a enzima lacase imobilizada em nanotubos de haloisita (HNT). Inicialmente, a dopamina é oxidada na superfície do biossensor a o-quinona, com a redução concomitante do oxigênio molecular a água. Em seguida, devido à aplicação de um potencial, elétrons são gerados na superfície, fazendo com que a o-quinona retorne à sua forma reduzida. A corrente resultante deste processo de oxidação e redução da dopamina, catalisado pela lacase, é medida. O oxigênio utilizado na reação é o dissolvido na água; a alta solubilidade do oxigênio e o baixo consumo pela enzima garantem oxigênio suficiente para a reação, dispensando controle da concentração de oxigênio no sistema.

A escolha do surfactante ImS3-14 é justificada nesta seção. Quatro surfactantes (ImS3-10, ImS3-12, ImS3-14 e ImS3-16), com a mesma estrutura básica mas diferentes tamanhos de cadeia hidrofóbica (10, 12, 14 e 16 carbonos), foram testados usando espectroscopia de impedância eletroquímica. Os resultados, apresentados na Figura 6, indicam que o eletrodo contendo o ImS3-14 apresentou a menor capacitância e resistividade à passagem de corrente. Este resultado sugere uma melhor organização do surfactante na pasta de carbono, facilitando a condução elétrica e o acesso do analito à superfície do eletrodo. A escolha do surfactante ideal para otimizar o desempenho do biossensor baseia-se em sua capacidade de facilitar o processo de transferência de elétrons e a interação com o analito. O aumento do número de carbonos da cauda do surfactante aumenta a hidrofobicidade, e consequentemente a resistividade. A diminuição do número de carbonos prejudica a propriedade tensoativa, comprometendo a organização e a eficácia do surfactante na pasta de carbono.

Nesta seção, o estudo da quantidade ideal de enzima para o biossensor é discutido. Diferentes concentrações de lacase, na faixa de 0,01 a 5,0 U mL⁻¹, foram investigadas. A maior resposta do biossensor foi obtida com a concentração de 0,05 U mL⁻¹ de lacase. Concentrações menores resultam em menor quantidade de dopamina oxidada e corrente gerada, devido à baixa distribuição da enzima na superfície. Por outro lado, concentrações maiores levam a um recobrimento excessivo da superfície, dificultando a passagem de corrente, mesmo com maior quantidade de enzima disponível para catálise. Assim, existe uma quantidade ótima de enzima que permite uma catálise eficiente e adequado recobrimento da superfície do biossensor. Essa otimização demonstra a importância de se definir a concentração ideal de enzima para o melhor desempenho do biossensor.

A influência individual e combinada dos modificadores (lacase, HNT e surfactante) é analisada. Sete sensores foram construídos e testados para detecção de dopamina. O EPC sozinho (a) apresentou baixa resposta. A adição de lacase (b) aumentou a resposta em 1,84 vezes, devido à sua atividade catalítica. O surfactante (c) aumentou a resposta em 2,49 vezes, facilitando o acesso do analito e transporte de elétrons. A HNT (d) aumentou a resposta em 10,47 vezes devido à sua elevada porosidade. A lacase imobilizada em HNT (e) aumentou a resposta em 12,54 vezes, combinando a porosidade da HNT e a catálise enzimática. A combinação de todos os três modificadores (g) resultou na maior resposta, demonstrando sinergismo entre eles. Os resultados demonstram que cada modificador contribui individualmente para o aumento da resposta, e a sua combinação produz um efeito sinérgico, resultando num biossensor com performance significativamente melhor.

A otimização das técnicas voltamétricas (voltametria de onda quadrada - VOQ e voltametria de pulso diferencial - VPD) é detalhada. Os parâmetros de cada técnica foram investigados para melhor desempenho. A VOQ mostrou maior resposta para dopamina, justificada pela sua maior velocidade, permitindo oxidação e redução em intervalo de tempo menor, aumentando a corrente de pico. Além disso, a VOQ ocorre nos dois sentidos (oxidação e redução), sobrepondo as correntes de pico e amplificando a corrente resultante em processos reversíveis ou parcialmente reversíveis. A escolha da técnica voltamétrica ideal é fundamental para a sensibilidade e precisão do biossensor. A comparação entre as técnicas mostra a superioridade da VOQ em termos de sensibilidade e rapidez da análise para o sistema em estudo.

Um estudo de interferentes foi realizado para avaliar a seletividade do biossensor. Foram testados diferentes compostos fenólicos, ácido úrico e ácido ascórbico. Os resultados preliminares indicam que nenhum desses compostos interfere significativamente, mas o estudo foi realizado individualmente. Para comprovar a ausência de interferência, um novo estudo com dopamina e interferentes na mesma solução seria necessário, um aspecto crucial para a validação do biossensor em amostras biológicas complexas. A seletividade do biossensor é uma característica fundamental, pois ele precisa ser capaz de detectar a dopamina em presença de outros compostos que podem estar presentes na amostra sem gerar falsos positivos ou resultados errôneos.

Estudos de reprodutibilidade e repetibilidade foram conduzidos para avaliar a confiabilidade do método. A reprodutibilidade entre biossensores foi avaliada construindo quatro eletrodos sob a mesma metodologia, obtendo desvios relativos de 7,0% para VOQ e 8,1% para VPD. A repetibilidade foi avaliada com dez medidas usando o mesmo biossensor, resultando em desvios relativos de 5,6% para VOQ e 8,5% para VPD. Os resultados demonstram boa reprodutibilidade e precisão do método, considerando a complexidade do biossensor. Esses dados comprovam a robustez e a confiabilidade do método proposto, que apresenta resultados consistentes mesmo com a complexidade do biossensor em questão.

A aplicação do biossensor em amostras farmacêuticas é avaliada. Duas ampolas de dopamina (5 mg mL⁻¹) foram analisadas usando o biossensor com VOQ e VPD, comparando os resultados com o método espectrofotométrico oficial (Farmacopéia Americana). Um estudo de curva de calibração por adição de padrão foi realizado para avaliar a interferência da matriz da amostra. Para o biossensor ser aplicável em controle de qualidade, as curvas de calibração por adição de padrão e padrão externo devem ser paralelas (coeficientes angulares iguais), indicando ausência de interferência da matriz. Os resultados obtidos pelo biossensor foram satisfatórios, próximos dos valores rotulados e dos obtidos pelo método oficial, demonstrando o potencial para o uso do biossensor em controle de qualidade de medicamentos. A validação do biossensor em amostras reais é fundamental para demonstrar sua aplicabilidade em um cenário prático.

A conclusão destaca a eficiência individual e sinérgica dos modificadores (lacase, nanotubos de haloisita - HNT, e surfactante ImS3-14) na resposta do biossensor. Cada modificador contribuiu individualmente para o aumento da resposta, mas a combinação deles resultou num aumento significativo da corrente do processo oxirredutor envolvendo a dopamina, mostrando um efeito sinérgico. A otimização das condições experimentais e instrumentais, incluindo a escolha do pH ótimo e das técnicas voltamétricas, também contribuiu para a melhora analítica, aumentando ainda mais a sensibilidade do método. A combinação de modificadores, bem como a otimização dos parâmetros, demonstrou a eficácia da estratégia adotada para aprimorar o desempenho do biossensor. O sucesso em otimizar cada componente e sua interação resultou em um aumento expressivo na capacidade de detecção.

A conclusão enfatiza o sucesso do biossensor na determinação de dopamina em amostras farmacêuticas e seu potencial para controle de qualidade de medicamentos. Os resultados de reprodutibilidade e precisão foram promissores, demonstrando a confiabilidade do método. A boa performance do biossensor, comprovada pela precisão e reprodutibilidade dos resultados, indica seu potencial como ferramenta para análise de dopamina em medicamentos. A possibilidade de utilização em controle de qualidade é realçada, abrindo perspectivas para aplicações em diferentes áreas. O biossensor mostrou-se eficiente em amostras farmacêuticas, demonstrando a sua potencial aplicabilidade em análises de rotina em controle de qualidade.