Catecolase: Síntese de Complexo de Cobre

A síntese do ligante N,N,N'-tris(2-metilpiridil)-N'(2-hidróxi-5-metilbenzaldeído)-propano-1,3-diamina (H1L1), um composto não-simétrico e multidentado, é detalhada. O processo envolveu etapas sequenciais, iniciando com a adição lenta de 1,3-propanodiamina a uma solução metanólica de 2-piridilcarboxialdeído, sob agitação magnética e banho de gelo. Após a adição, a agitação foi mantida por quatro horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida, seguido de uma etapa de hidrogenação utilizando etanol como solvente, com pressão de 45 psi por 15 horas, empregando Pd/C como catalisador. O produto, um óleo amarelado com rendimento de 78,2%, foi caracterizado por espectroscopia de infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H). Etapas subsequentes envolveram adição de NaOH 15% (m/v), agitação por 3 horas, remoção do solvente, ajuste de pH para aproximadamente 9, extração com diclorometano, secagem e remoção do solvente resultando num óleo amarelado com 89,5% de rendimento. Finalmente, após reação de abertura de anel, lavagens com solução saturada de bicarbonato de sódio e secagem, obteve-se um óleo amarelo escuro com 94% de rendimento. A caracterização completa do H1L1 incluiu ESI-MS, IV, e RMN 1H e 13C, assegurando sua pureza e adequabilidade para a síntese do complexo de cobre.

O complexo de cobre(II) foi sintetizado adicionando o ligante H1L1 dissolvido em metanol a uma solução metanólica de Cu(ClO4)2.6H2O. A precipitação do complexo iniciou-se com a adição de metade da solução de H1L1 e continuou até o fim da adição do ligante, resultando num pó verde. A caracterização do complexo envolveu diversas técnicas espectroscópicas e eletroquímicas. A espectroscopia de infravermelho (IV) revelou informações sobre as ligações e a coordenação do ligante ao íon metálico, observando-se a banda de deformação axial O-H, indicando a presença de espécies com fenol protonado. A espectrometria de massas (ESI-MS) confirmou a formação do complexo, identificando o íon molecular protonado [C30H32CuN5O2]+ e seus isótopos. A espectroscopia eletrônica UV-Vis, tanto em solução quanto por reflectância difusa, forneceu informações sobre a geometria do complexo, sugerindo uma geometria octaédrica em solução e piramidal de base quadrada no estado sólido. O comportamento redox foi investigado por voltametria cíclica, mostrando um sistema irreversível. A condutivimetria indicou o equilíbrio de espécies protonadas e desprotonadas do fenol. A titulação espectrofotométrica determinou o pKa de desprotonação do fenol coordenado ao cobre(II) como sendo 5,17.

A caracterização do ligante e do complexo utilizou diversas técnicas espectroscópicas. Na espectroscopia de infravermelho (IV), a formação do intermediário 2pyprop foi confirmada pela banda de amina secundária e ausência de bandas de estiramento carbonila e amina primária. Para o ligante H1L1, a banda de estiramento axial C=O em 1675 cm-1 e a banda de deformação axial O-H do fenol em 3423 cm-1 foram características importantes. A RMN 1H forneceu informações detalhadas sobre o acoplamento de spin e deslocamentos químicos, auxiliando na identificação dos produtos em cada etapa de síntese. A RMN 13C complementou a caracterização estrutural. A espectrometria de massas (ESI-MS) confirmou a massa molecular do ligante H1L1 e a composição do complexo, mostrando a razão massa/carga esperada e a distribuição isotópica. A análise dos espectros de RMN, em especial a identificação dos picos da metila (2,24 ppm) e do aldeído (10,28 ppm) no H1L1, ajudou a confirmar a estrutura do ligante final. A espectroscopia eletrônica UV-Vis permitiu identificar transições eletrônicas d-d e de transferência de carga (TCLM) π(fenolato)→Cu(II), fornecendo informações valiosas sobre a geometria e a influência do pH no complexo de cobre.

A atividade de catecolase do complexo de cobre(II) sintetizado foi avaliada através de testes cinéticos de oxidação do 3,5-di-terc-butilcatecol (3,5-DTBC), um substrato modelo. Esses ensaios investigaram a influência do pH e da concentração do substrato na velocidade da reação de oxidação. A metodologia envolveu a monitoração da reação em diferentes condições de pH (4,0 a 10,0) e concentrações de 3,5-DTBC, utilizando cubetas de vidro óptico, tampões (MES e TRIS), metanol saturado com oxigênio e soluções do complexo e do substrato em concentrações específicas. A reação foi monitorada durante 15 minutos. Soluções de referência, sem o complexo, foram utilizadas para corrigir a oxidação espontânea do 3,5-DTBC dependente do pH. Os resultados mostraram uma região de atividade nula em pH ácido, uma região intermediária onde a atividade aumenta com o pH e uma região de atividade praticamente constante em pH mais alto. O ponto em pH 10 foi excluído devido à baixa atividade, possivelmente por precipitação ou formação de hidróxido de metal. A análise da curva de atividade em função do pH permitiu a determinação do pKa cinético da reação, embora frequentemente mascarado pelo pKa do próprio substrato.

A ausência da observação da banda de absorção do intermediário semiquinona durante os ensaios sugere que a transferência de elétrons na oxidação do 3,5-DTBC pelo complexo de cobre(II) pode ocorrer de maneira simultânea por dois centros de cobre, mesmo sendo o complexo mononuclear. Uma hipótese para explicar esse comportamento é a formação de estruturas dímeras ou tetraméricas do complexo em solução, com possível interação de um átomo de oxigênio do substrato com íons cobre de unidades mononucleares adjacentes. Essa hipótese é discutida em comparação com estudos na literatura sobre complexos mononucleares de cobre que apresentam atividade de catecolase. A literatura sugere que, para complexos mononucleares, a reação com catecol resulta na formação da espécie intermediária semiquinona, porém, neste caso, este intermediário não foi observado. A comparação da atividade catalítica e das propriedades físico-químicas do complexo sintetizado com as da enzima catecol oxidase natural fornece subsídios para avaliar sua eficiência como um modelo funcional para a reação de oxidação de catecóis.

A espectroscopia no infravermelho (IV) foi crucial para a caracterização do ligante H1L1 e do complexo de cobre(II) em todas as etapas da síntese. Para o intermediário 2pyprop, a presença da banda característica de amina secundária e a ausência das bandas de estiramento carbonila e amina primária confirmaram sua formação e a redução da imina. No ligante H1L1, a identificação da banda de estiramento axial C=O (1675 cm-1) e da banda de deformação axial O-H do fenol (3423 cm-1) foram fundamentais. Adicionalmente, bandas em 1367 e 1220 cm-1, atribuídas à interação entre a deformação angular de O-H e a deformação axial de C-O, também contribuíram para a caracterização. No complexo de cobre(II), a banda de deformação axial O-H indicou que, na coordenação, o fenol permanece parcialmente protonado. A comparação das bandas de estiramento C=N da piridina no ligante e no complexo permitiu observar o enfraquecimento desta ligação após a coordenação ao metal, evidenciando a formação da ligação simples C-N. A análise das frequências de absorção, dependentes das massas atômicas, constantes de força das ligações e geometrias moleculares, possibilitou o acompanhamento da formação dos compostos ao longo da síntese. A variação nas frequências de vibração após a coordenação ao metal confirmou as mudanças na força das ligações.

A ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C foi usada extensivamente na caracterização dos compostos. A RMN de 1H forneceu informações detalhadas, indo além das informações do infravermelho e espectrometria de massas, permitindo a observação dos valores de deslocamento químico (δ em ppm) e o número de átomos de hidrogênio correspondentes. O acoplamento de spin, resultante da interação indireta entre os spins dos hidrogênios através dos elétrons de ligação, foi interpretado para elucidar a estrutura. A intensidade dos sinais era proporcional ao número de hidrogênios. Para o ligante H1L1, a RMN 1H ajudou a caracterizar cada produto em todas as etapas da síntese, com os deslocamentos químicos refletidos nos efeitos de blindagem eletrônica sofrida por cada próton. A identificação de picos específicos, como a metila (2,24 ppm) e o aldeído (10,28 ppm) na última etapa, foi crucial para confirmar a estrutura. A RMN 1H também permitiu observar a mudança de CH para CH2 em 3,89 ppm no 3py-A, confirmando a abertura do anel. Hidrogênios ligados a nitrogênio, oxigênio e enxofre, sujeitos a ligações de hidrogênio e influenciados por fatores como concentração e temperatura, não foram usados como critérios principais de caracterização.

A espectrometria de massas (ESI-MS) foi empregada principalmente para a caracterização do ligante H1L1 e do complexo de cobre(II). Para o ligante, o espectro de massas mostrou um pico de maior intensidade com razão m/z = 496,26, correspondente ao íon molecular protonado [496,26]+, confirmando sua massa molecular. A distribuição isotópica simulada pelo software “Mmass” e comparada ao espectro experimental validou a composição do ligante. No complexo, o pico de maior intensidade foi atribuído ao íon molecular [C30H32CuN5O2]+, indicando a coordenação do ligante ao íon metálico e a desprotonação do fenol durante a análise. A presença dos isótopos de menor abundância nos picos de m/z = 558,19; 559,19; 560,19; e 561,19, também simulados pelo software, reforçou a formação do complexo. Em resumo, a ESI-MS foi fundamental na confirmação da massa molecular e da composição tanto do ligante como do complexo, fornecendo evidências importantes para a caracterização estrutural.

A espectroscopia eletrônica UV-Vis foi utilizada para investigar as transições eletrônicas no complexo de cobre(II). A análise em solução revelou uma banda com comprimento de onda máximo de 630 nm, correspondente à transição eletrônica interna d-d do Cu2+. O coeficiente de absorção calculado (ε = 101 L mol-1 cm-1) indicou transições permitidas por spin e proibidas por Laporte, sugerindo uma geometria octaédrica, possivelmente com uma molécula de solvente ocupando a sexta posição de coordenação. A espectroscopia de reflectância difusa, realizada no estado sólido, apresentou um comprimento de onda máximo deslocado para 750 nm, indicando um ambiente de coordenação diferente do observado em solução. O alargamento das bandas impossibilitou prever a transferência de carga no estado sólido. Entretanto, a presença de um ombro em menor energia no espectro de reflectância difusa sugere uma geometria piramidal de base quadrada para o complexo no estado sólido. A análise combinada da espectroscopia UV-Vis em solução e reflectância difusa permitiu a proposição de diferentes geometrias do complexo em diferentes estados físicos.

A condutivimetria e a titulação espectrofotométrica forneceram informações complementares sobre o complexo de cobre(II). As medidas de condutividade molar indicaram um equilíbrio entre espécies protonadas e desprotonadas do fenol em solução, dependendo do solvente (CH3CN e MeOH). A titulação espectrofotométrica, realizada em um espectrofotômetro UV-Vis Varian Cary 50 BIO acoplado a um banho termostatizado a 25°C, investigou esse equilíbrio de espécies em função do pH. O deslocamento do comprimento de onda máximo da transferência de carga ligante-metal (TCLM) com o aumento do pH e a presença de pontos isosbésticos confirmaram a existência de um equilíbrio entre as espécies com fenol protonado e desprotonado (fenolato). A análise da curva sigmoidal de absorbância vs pH permitiu a determinação do pKa de desprotonação do fenol como 5,17, um valor consistente para fenóis coordenados ao íon Cu2+ na posição axial, influenciados pelo efeito Jahn-Teller. Em resumo, ambas as técnicas forneceram informações valiosas sobre a influência do pH na estrutura e no equilíbrio de espécies em solução.

A voltametria cíclica foi empregada para investigar o comportamento redox do complexo de cobre(II). Os experimentos foram realizados em um potenciostato/galvanostato modelo Epsilon, utilizando uma célula eletrolítica com eletrodo de referência Ag/AgCl (BASi), eletrodo de trabalho de carbono vítreo e eletrodo auxiliar de platina. O complexo foi analisado em solução aquosa (1,0 x 10-3 mol L-1) com NaClO4 (0,2 mol L-1) como eletrólito suporte, sob atmosfera de argônio. Os resultados mostraram um sistema redox irreversível, atribuído à mudança no ambiente de coordenação dos íons Cu(II) e Cu(I) durante o processo redox. O estudo eletroquímico forneceu informações importantes sobre o potencial redox do complexo, que é um parâmetro relevante para entender sua capacidade de transferência de elétrons e sua atuação como um catalisador na reação de oxidação do 3,5-DTBC.