Padronização in vitro: Leucemias e linfomas

O documento inicia ressaltando a alta mortalidade por câncer no Brasil, com as leucemias e o linfoma não-Hodgkin entre os dez tipos mais frequentes. Este cenário justifica a importância da investigação do potencial genotóxico e mutagênico de fármacos e substâncias químicas, crucial para a prevenção e tratamento do câncer. O Ensaio Cometa e o Teste do Micronúcleo, in vitro e in vivo, são métodos recomendados por órgãos reguladores para essa avaliação, porém sua padronização é fundamental para garantir resultados reprodutíveis e confiáveis. O objetivo central é revisar a aplicação in vitro desses testes e analisar a padronização de seus protocolos em diferentes linhagens celulares de leucemia e linfoma, avaliando o impacto da variabilidade dos protocolos na reprodutibilidade das metodologias. Uma revisão bibliográfica foi conduzida, resultando na análise de 39 artigos científicos que abordaram diferentes aspectos da genotoxicidade e dos métodos em questão, incluindo investigação de novos fármacos, mecanismos de ação e potencial genotóxico/mutagênico de substâncias químicas. A análise comparativa dos protocolos revela diferenças significativas nos tempos e nas fórmulas das soluções utilizadas, com o Ensaio Cometa apresentando maior variabilidade que o Teste do Micronúcleo.

A revisão bibliográfica resultou na seleção de 39 artigos científicos. Destes, 11 investigaram novos fármacos ou o aprimoramento de antineoplásicos; 10 estudaram os mecanismos de ação de fármacos/substâncias químicas; 9 investigaram o potencial genotóxico/mutagênico de substâncias químicas; 4 artigos focaram nos mecanismos de transformação maligna das células; e 4 investigaram a confiabilidade do Teste do Micronúcleo in vitro sem o bloqueio da citocinese. A análise comparativa dos protocolos que utilizaram as mesmas linhagens celulares revelou diferenças significativas tanto nos tempos de incubação quanto nas fórmulas das soluções empregadas. Observou-se que o Ensaio Cometa apresentou maior variabilidade entre os artigos do que o Teste do Micronúcleo, indicando uma maior necessidade de padronização para o primeiro método. Esta constatação ressalta a importância da padronização para garantir a reprodutibilidade e a confiabilidade dos resultados em estudos de genotoxicidade, especialmente considerando a complexidade do processo carcinogênico e a diversidade de fatores envolvidos.

A conclusão principal é que, apesar da existência de protocolos estabelecidos na literatura para o Ensaio Cometa e o Teste do Micronúcleo, adaptações pontuais são necessárias para diferentes particularidades experimentais, incluindo o uso de diferentes linhagens celulares. A observação de diferenças significativas nos protocolos, mesmo quando as mesmas linhagens celulares foram usadas, reforça a dificuldade de padronização. A falta de padronização compromete a reprodutibilidade e a confiabilidade dos resultados, dificultando a comparação entre estudos realizados em diferentes laboratórios. A recomendação final é a utilização de protocolos específicos para cada linhagem celular, a fim de promover a padronização entre laboratórios e, consequentemente, gerar resultados mais confiáveis e reprodutíveis. Essa padronização é fundamental para avançar na pesquisa de genotoxicidade de fármacos e na busca por novas terapias contra o câncer.

A análise da literatura científica revelou uma significativa variabilidade nos protocolos do Ensaio Cometa, mesmo quando estudos utilizaram as mesmas linhagens celulares. Essa falta de padronização afeta diretamente a reprodutibilidade dos resultados. As discrepâncias observadas incluem a concentração de agarose (tanto agarose low melting quanto agarose normal), com Azqueta e Collins (2013) e Olive e Banáth (2006) apontando concentrações ideais diferentes e a influência da concentração na migração do DNA na cauda do cometa. O tempo de descanso em solução alcalina também variou, com sugestões de 10 a 60 minutos na literatura, impactando diretamente no desenrolamento do DNA e na porcentagem de DNA na cauda. Outro ponto de divergência foi a utilização de N-laurilsarcosil na solução de lise, com alguns autores sugerindo sua necessidade para lise total das membranas celulares e outros afirmando que o Triton X-100 é suficiente. A voltagem, amperagem e tempo de eletroforese também apresentaram variações, comprometendo a padronização. A falta de informações detalhadas em alguns estudos sobre o tempo de execução de cada etapa do protocolo intensifica ainda mais a dificuldade de reprodutibilidade. A inconsistência nos protocolos, mesmo para as mesmas linhagens celulares, demonstra a necessidade urgente de uma padronização mais rigorosa para garantir a confiabilidade e a comparabilidade dos resultados do Ensaio Cometa.

Diversos parâmetros do Ensaio Cometa mostraram-se cruciais para a reprodutibilidade dos resultados. A concentração da agarose low melting, idealmente entre 0,6% e 0,8%, influencia diretamente na migração da cauda do cometa, sendo que concentrações mais altas resultam em menor migração e concentrações mais baixas em maior migração (Azqueta e Collins, 2013). Já a concentração de agarose normal, recomendada entre 1% e 1,5%, impacta na adesão do gel à lâmina, evitando o desprendimento durante a eletroforese (Olive e Banáth, 2006). O tempo de descanso em solução alcalina, essencial para a desnaturação do DNA, também é crítico. Para a eletroforese, a utilização da voltagem por centímetro (V/cm) é considerada mais precisa que a medida em volts (V) e miliampères (mA), sendo que voltagens entre 0,7 e 1,0 V/cm são comumente usadas. Entretanto, observa-se grande variabilidade no tempo de corrida, dependendo do tipo celular e da proposta experimental, com a migração mínima de DNA nas células controle sendo um parâmetro essencial para validação experimental. A neutralização dos géis, após a eletroforese, requer a utilização de uma solução de Tris em pH 7,5 para neutralizar a solução alcalina, enquanto que a lavagem apenas com água destilada se mostrou ineficaz. Por fim, a desidratação do gel com etanol ou metanol absoluto é recomendada para evitar difusão excessiva do DNA.

A análise de diferentes estudos que utilizaram a mesma linhagem celular no Ensaio Cometa revelou variações significativas nos protocolos. Por exemplo, a inclusão ou não do N-laurilsarcosil na solução de lise varia entre os trabalhos, apesar de discussões na literatura sobre sua real necessidade na presença do Triton X-100. Outros exemplos de variação incluem a densidade celular utilizada, o tempo de tratamento, a voltagem/amperagem e o tempo de eletroforese, o tempo de neutralização e o tipo de fixação e coloração. Alguns estudos apresentaram falta de informações detalhadas sobre os tempos de execução de etapas específicas do protocolo, dificultando a reprodução dos experimentos. A padronização das concentrações de agaroses (low melting e normal) e o tempo de descanso de 20 minutos em solução alcalina em pH > 13, apesar de sugeridos na literatura, também não foram consistentemente seguidos. Essas inconsistências demonstram a ausência de um protocolo padrão para o Ensaio Cometa, mesmo para a mesma linhagem celular, impactando diretamente na reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados, e comprometendo a comparação de dados entre diferentes laboratórios.

O Teste do Micronúcleo (in vitro) é uma metodologia versátil e precisa para detectar efeitos mutagênicos, citostáticos (parada da proliferação celular) e citotóxicos em células de mamíferos, frequentemente utilizado com linfócitos humanos ou linhagens celulares. O teste, na sua versão com bloqueio da citocinese (CBMN), visualiza danos cromossômicos em células binucleadas (após apenas uma divisão nuclear). Esses danos incluem perdas (aneugênese) e quebras (clastogênese) cromossômicas, expressas como micronúcleos (MN); cromossomos dicêntricos e pontes nucleoplasmáticas (NPBs), resultantes da fusão de telômeros ou falha no reparo do DNA; e brotos nucleares (NBUDs), relacionados à eliminação de amplificações ou defeitos no sistema de reparo do DNA. A detecção desses marcadores indica instabilidade cromossômica. Os efeitos citostáticos são mensurados pela proporção de núcleos (mono, bi ou multinucleados) em cada célula, e a citotoxicidade pela relação de células apoptóticas e/ou necróticas. Micronúcleos originam-se na anáfase pela extrusão de fragmentos cromossômicos acêntricos ou cromossomos inteiros, decorrentes de falhas no reparo de quebras de fita dupla ou segregação anômala na anáfase, potencialmente causada por hipometilação de regiões centroméricas e pericentroméricas do DNA ou defeitos no cinetocoro, nos fusos mitóticos ou nos genes envolvidos nos checkpoints da anáfase. A confiabilidade do CBMN advém da sincronização celular na mesma etapa da divisão nuclear, alcançada pela adição de citocalasina B, que inibe a citocinese sem interferir na divisão nuclear.

A pesquisa analisou estudos que utilizaram o Teste do Micronúcleo com e sem citocalasina B (CBMN). A citocalasina B bloqueia a citocinese, garantindo que os micronúcleos observados sejam de células que passaram por pelo menos uma divisão celular após a indução do dano. Essa abordagem aumenta a confiabilidade dos resultados. Contudo, a literatura mostra variações na concentração da citocalasina B (3 a 6 µg/ml) e no tempo de incubação (18 a 24 horas), além de variações na densidade celular, tempos de tratamento e utilização de choque hipotônico. Embora o bloqueio da citocinese ofereça vantagens (contabilização de células binucleadas e mononucleadas para confirmação de eventos aneugênicos), Kirsch-Volders e colaboradores (2011) argumentam que a ausência de citocalasina B não impacta significativamente os resultados em linhagens celulares estáveis, devido à menor variabilidade no tempo de ciclo celular em comparação com células do sangue periférico. A contagem de micronúcleos em células mononucleadas é importante, refletindo instabilidade genômica similar ao sistema in vivo, enquanto a contagem em células binucleadas indica mutações acumuladas in vitro.

A utilização de solução hipotônica é crucial para a análise de amostras de sangue periférico, pois permite eliminar eritrócitos e melhorar a visualização das células. No entanto, ela é desnecessária em culturas de linhagens celulares. Fenech (2007) destaca a importância da fixação celular (metanol ou ácido acético 3:1) e da preparação cuidadosa das lâminas para a qualidade da contagem de micronúcleos. A revisão bibliográfica indicou que algumas pesquisas foram conduzidas sem citocalasina B para avaliar sua capacidade de detectar eventos mutagênicos com precisão. Em geral, observou-se menor variabilidade nos protocolos do Teste do Micronúcleo comparado ao Ensaio Cometa, provavelmente devido à sua inclusão em baterias de testes toxicológicos iniciais para avaliação de genotoxicidade. Apesar disso, variações na concentração da citocalasina B, tempo de incubação, densidade celular, tempos de tratamento, uso de choque hipotônico e métodos de fixação e coloração foram observadas em estudos com a mesma linhagem celular. A necessidade de padronização para garantir reprodutibilidade e confiabilidade é evidente também neste teste.

O Ensaio Cometa e o Teste do Micronúcleo foram amplamente utilizados nos artigos revisados para avaliar a genotoxicidade de antineoplásicos e outras substâncias químicas. Estudos investigaram tanto o potencial de novos fármacos quanto o aprimoramento da eficácia de antineoplásicos já existentes. A análise dos mecanismos de ação desses compostos também foi um foco importante, buscando compreender como eles interagem com o DNA e induzem danos genéticos. Em particular, a capacidade de detectar danos no DNA e alterações cromossômicas, como micronúcleos, foi crucial para a avaliação do potencial carcinogênico e para a busca de alvos terapêuticos. A combinação dos dois testes in vitro permitiu uma avaliação mais abrangente, com a possibilidade de detectar diferentes tipos de danos genéticos e, também, avaliar a eficácia dos antineoplásicos em diferentes linhagens celulares, revelando a heterogeneidade da resposta a esses tratamentos. A eficácia variável de um mesmo antineoplásico em diferentes linhagens celulares demonstra a complexidade do câncer e a necessidade de tratamentos direcionados.

O documento cita vários exemplos de estudos que utilizaram o Ensaio Cometa e/ou o Teste do Micronúcleo. Um estudo visou melhorar os efeitos da asparaginase, utilizada em tratamentos de leucemias e linfomas infantis, diminuindo seus efeitos imunogênicos e aumentando sua citotoxicidade. Outro trabalho investigou o mecanismo pelo qual o selênio auxilia os tratamentos quimioterápicos em linhagens de células B de linfomas, demonstrando seu efeito na regulação de mediadores da resposta ao estresse e na supressão do fator nuclear-κB (NF-κB), importante em muitos cânceres por conferir resistência a fármacos. A pesquisa com o extrato de Chan Su, usado na medicina chinesa, mostrou indução significativa de danos ao DNA e formação de micronúcleos em células leucêmicas e de carcinoma, mas não em linfócitos saudáveis, sugerindo seu potencial antineoplásico. Outros estudos investigaram os efeitos genotóxicos do picolinato de cromo, do SR-51 (uma mistura de solventes) e do dimetil maleato. Esses exemplos demonstram a ampla aplicabilidade dos testes em diversas áreas, da investigação de mecanismos de ação de fármacos ao estudo do potencial genotóxico de substâncias químicas presentes no ambiente.

A revisão bibliográfica destaca a importância dos testes in vitro, como o Ensaio Cometa e o Teste do Micronúcleo, na pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos, particularmente antineoplásicos. Os testes in vitro, utilizando linhagens celulares malignas, oferecem vantagens em relação aos testes in vivo, como a possibilidade de limitar o número de variáveis experimentais, obtenção de resultados mais rápidos e com menor custo. A capacidade de reproduzir resultados, a rapidez, a sensibilidade e o baixo custo financeiro são apontadas como vantagens significativas. O uso de linhagens celulares também permite melhor controle da homogeneidade das amostras, em contraste com o uso de animais. A utilização combinada do Ensaio Cometa e do Teste do Micronúcleo in vitro, é vista como um padrão ouro nos testes citogenéticos, permitindo um estudo mais completo e economizando recursos, e reduzindo o número de animais utilizados no desenvolvimento de novos fármacos. Apesar de amplamente empregado, o Ensaio Cometa ainda está em processo de aceitação total por órgãos reguladores, ao contrário do Teste do Micronúcleo.

A revisão bibliográfica destacou a necessidade de padronização dos protocolos para o Ensaio Cometa e o Teste do Micronúcleo, mesmo para as mesmas linhagens celulares. Apesar da existência de protocolos estabelecidos, a grande variabilidade observada entre os estudos analisados, principalmente no Ensaio Cometa, compromete a reprodutibilidade e a confiabilidade dos resultados. A falta de uniformidade em parâmetros como concentração de reagentes (agarose, N-laurilsarcosil, Triton X-100), tempos de incubação e parâmetros de eletroforese, dificulta a comparação entre diferentes pesquisas. A padronização é crucial para que os resultados sejam confiáveis e reprodutíveis em diferentes laboratórios, assegurando maior validade científica e contribuindo para o desenvolvimento de novas terapias e o avanço no conhecimento sobre genotoxicidade.

A padronização dos protocolos para o Ensaio Cometa e o Teste do Micronúcleo em diferentes linhagens celulares se mostrou desafiadora. A maioria dos artigos analisados não descreve de forma exata o procedimento de cada etapa, e os protocolos padronizados por organizações internacionais como a OECD e a ICH geralmente não fornecem detalhes específicos para cada tipo de linhagem celular. Esta falta de especificidade força os pesquisadores a recorrerem ao método da "tentativa e erro", um processo longo e dispendioso em termos de tempo e recursos. A dificuldade encontrada pelos autores, inclusive em suas próprias experiências em laboratório, reforça a necessidade de uma padronização mais detalhada e específica para diferentes linhagens celulares. Esta padronização melhoraria significativamente a eficiência da pesquisa e reduziria custos, propiciando avanços mais rápidos e confiáveis na área.

Em virtude das dificuldades encontradas na padronização dos protocolos do Ensaio Cometa e do Teste do Micronúcleo (especialmente para as linhagens Jurkat T e K562), a pesquisa sugere a adoção de protocolos específicos para cada linhagem celular. Essa abordagem permitiria uma maior reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados, facilitando a comparação entre diferentes estudos e laboratórios. A utilização de protocolos padronizados para cada linhagem é fundamental para obter resultados mais precisos e válidos, contribuindo significativamente para o avanço da pesquisa em genotoxicidade e no desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento do câncer. O estudo reforça que a padronização não é apenas um detalhe técnico, mas uma necessidade fundamental para a credibilidade e o impacto da pesquisa científica nesta área.