Sequenciamento MODY: Análise Molecular

A introdução contextualiza o desafio do diagnóstico preciso de MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young) ou Diabetes Monogênico do Jovem. A alta taxa de casos não confirmados, classificados como MODY X (suspeita clínica sem identificação genética), destaca a necessidade de métodos diagnósticos mais eficientes. O estudo propõe a utilização do sequenciamento de nova geração (NGS), através de um painel customizado de Sequenciamento de Ligação em Alta Densidade (SLE), como uma abordagem inovadora para superar as limitações do sequenciamento Sanger tradicional. A heterogeneidade genética da MODY, com mais de 14 genes associados a diferentes subtipos, torna o diagnóstico complexo e ressalta a necessidade de uma metodologia que abarque uma gama mais ampla de genes. A pesquisa busca aprimorar a acurácia diagnóstica e reduzir a prevalência de casos MODY X, especialmente no contexto da população brasileira. O enfoque em pacientes com resultados negativos em testes prévios de Sanger evidencia a necessidade de uma tecnologia mais abrangente para esclarecer a base genética da doença.

A metodologia detalha o processo de seleção dos pacientes e a abordagem técnica empregada. Inicialmente, foram recrutados 152 pacientes com suspeita clínica de MODY. Após a aplicação de critérios de inclusão, 15 pacientes foram excluídos, restando 137 casos para análise. Destes, 88% provinham de estudo prévio em diabetes monogênico da USP, e os 12% restantes de investigação genética prévia negativa na Universidade Federal de São Paulo. Todos os pacientes selecionados para o estudo por painel de SLE tinham apresentado resultados negativos em testes de sequenciamento Sanger prévios, nos quais foram sequenciados os éxons dos genes GCK ou HNF1A, dependendo do fenótipo apresentado. O estudo utilizou um painel de SLE customizado, criado através da ferramenta Agilent SureDesign, que inclui 51 genes associados a diferentes tipos de diabetes monogênico. Este painel abrange 14 genes de MODY (7 exclusivos para MODY e 7 compartilhados com diabetes neonatal), 17 genes associados apenas a diabetes neonatal, além de genes relacionados a diabetes autoimune, síndrome de Wolfram, resistência insulínica, lipodistrofia e hiperinsulinismo hiperinsulinêmica familiar (HHF). A inclusão dos genes de HHF foi justificada pela possível associação com MODY em alguns casos. A extração do DNA foi realizada a partir de leucócitos de sangue periférico, seguindo protocolos padronizados. A análise dos dados gerados pelo SLE priorizou os 14 genes de MODY e posteriormente genes candidatos relacionados a diabetes neonatal e HHF.

Os resultados demonstram a eficácia do painel de SLE no diagnóstico de MODY. De 80 pacientes analisados, 16 (20%) apresentaram variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas, confirmando o diagnóstico molecular. Descontando os 5 falsos negativos atribuídos ao sequenciamento Sanger (taxa de erro similar a estudos prévios), a positividade do painel de SLE cai para 14%. Considerando os 15 casos com variantes de significado incerto que podem ser reclassificados como patogênicos futuramente, a positividade aumentaria para 39%. A análise revelou 6 variantes no gene GCK, 1 em HNF1A, 1 em HNF4A, 1 em HNF1B, 6 em genes de MODY raros e 1 em um gene de diabetes neonatal. As variantes em GCK já haviam sido descritas em outras populações. As variantes não detectadas previamente pelo sequenciamento Sanger foram atribuídas a falsos negativos (erro no eletroferograma e alelic dropout) ou erros na hipótese clínica inicial. Um caso de MODY5 (HNF1B) só foi identificado após exames de imagem revelarem alterações renais. O estudo detectou variantes em genes anteriormente não associados à MODY, sinalizando a necessidade de mais pesquisas para confirmação da causalidade. Os 42 casos restantes sem etiologia esclarecida após o SLE podem se dever a variantes não investigadas neste estudo (regiões regulatórias, grandes deleções, etc.) ou a outros tipos de diabetes com sobreposição fenotípica.

A discussão contextualiza os achados do estudo em relação a outras pesquisas internacionais. A performance do painel de SLE (20% de positividade) se compara a estudos similares, que reportaram positividades entre 11% e 33% em pacientes com testes Sanger prévios negativos. Este estudo foi o primeiro a utilizar SLE para o diagnóstico de MODY na população brasileira, utilizando um painel com 51 genes. A prevalência de MODY no Brasil pode ser maior que em países como o Reino Unido, justificando o valor de corte de frequência alélica utilizado no estudo (acima de 0,01%). A discussão aborda a classificação das variantes alélicas, mencionando os critérios da ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics) e a importância de estudos adicionais (segregação familiar, estudos funcionais) para determinar a patogenicidade de variantes de significado incerto. O estudo também reconhece limitações, como a impossibilidade de analisar variantes em regiões regulatórias ou grandes deleções, e a dificuldade de estabelecer padrões fenotípicos claros para subtipos raros de MODY. A impossibilidade de uma previsão prognostica clara em casos associados a formas raras de MODY reforça a necessidade de estudos mais abrangentes utilizando a técnica de SLE para melhor caracterizar esses casos. As limitações de modelos animais para validação funcional de variantes alélicas também são mencionadas.

O texto define o MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young) como uma forma de diabetes mellitus monogênico do jovem, caracterizada por um defeito genético primário na secreção de insulina. Cada subtipo de MODY está associado a um gene distinto, o que demonstra a grande heterogeneidade genética da doença. Inicialmente classificado em 6 subtipos até 2005, atualmente já foram descritas mutações em 14 genes diferentes, com os subtipos 12, 13 e 14 identificados recentemente. Essa contínua descoberta de novos genes evidencia a complexidade genética da MODY e a necessidade de abordagens diagnósticas mais abrangentes para alcançar um diagnóstico preciso e direcionar o tratamento adequado. A diversidade genética representa um desafio significativo para o diagnóstico e o manejo clínico da doença, justificando a busca por métodos de sequenciamento genético mais eficazes e abrangentes, como o sequenciamento de nova geração (NGS).

A seção descreve os subtipos mais frequentes de MODY: MODY 3 (associado ao gene HNF1A), MODY 2 (associado ao gene GCK) e MODY 1 (associado ao gene HNF4A). O MODY 3, causado por variantes no gene HNF1A (localizado no cromossomo 12q), é o subtipo mais frequente em grandes coortes estudadas. O gene HNF1A codifica um fator de transcrição essencial para a diferenciação e funcionamento das células β, regulando a expressão do gene da insulina e outros genes envolvidos no metabolismo da glicose. Mais de 400 variantes diferentes já foram descritas em HNF1A. O MODY 2, associado a mutações no gene GCK (glicoquinase, localizado no cromossomo 7), é o subtipo mais frequente na França, Itália, Espanha, Alemanha e Áustria. Já foram identificadas mais de 600 mutações diferentes em GCK. Variantes em GCK causam redução na fosforilação da glicose, afetando a sensibilidade das células beta ao nível glicêmico e a secreção de insulina. O fenótipo é geralmente marcado por hiperglicemia leve, assintomática e estável. O MODY 1, causado por mutações no gene HNF4A (fator de transcrição localizado no cromossomo 20), apresenta características clínicas semelhantes ao MODY 3, mas difere no perfil lipídico (níveis reduzidos de HDL colesterol) e na ausência de redução no limiar renal de reabsorção de glicose. A prevalência varia entre países, sendo MODY 2 e MODY 3 os mais comuns em todas as populações estudadas, representando até 84% dos casos em uma grande casuística do Reino Unido. As diferenças na prevalência podem ser atribuídas às variações nos métodos de investigação.

A seção discute o conceito de MODY X, que define os casos com quadro clínico sugestivo de MODY, mas sem mutações identificadas nos genes conhecidos. A prevalência de MODY X na literatura varia significativamente, podendo chegar a até 65% dos casos com suspeita clínica. Esses casos representam uma importante fonte de informação para a identificação de novas mutações e/ou novos genes relacionados à MODY. A análise genética é crucial para o diagnóstico preciso, classificação do subtipo de MODY e prognóstico. A confirmação molecular não só define o subtipo como também direciona o tratamento e o aconselhamento genético para familiares, que têm um risco de 50% de herdar a mutação. O sequenciamento Sanger, embora fundamental, apresenta limitações: custo elevado, tempo prolongado de análise, heterogeneidade genética (14 genes distintos) e dificuldade em estudar genes grandes (como ABCC8). Rotineiramente, o Sanger se concentra nos genes GCK e HNF1A, os mais prevalentes. Genes raros são raramente sequenciados, exceto em estudos específicos. A ausência de estudos com SLE (Sequenciamento de Ligação em Alta Densidade) para diagnóstico de MODY no Brasil é também destacada. A dificuldade em estabelecer um padrão fenotípico claro para os diferentes subtipos de MODY, principalmente aqueles menos comuns, é também enfatizada, destacando a necessidade de mais pesquisas para melhor caracterizar esses casos.

O diagnóstico do Diabetes Monogênico do Jovem (MODY) requer uma abordagem que combine a suspeita clínica com a confirmação por meio de exames genético-moleculares. A análise genética é fundamental, pois permite não apenas confirmar o diagnóstico, mas também classificar o subtipo específico de MODY. Essa classificação tem impacto clínico relevante na previsão do prognóstico e na definição do tratamento, direcionando-o para o manejo específico de cada subtipo. Além disso, a análise genética é essencial para o aconselhamento genético, uma vez que parentes de primeiro grau têm 50% de chance de herdar a mutação. O rastreamento da condição genética é crucial tanto para o paciente quanto para sua família, permitindo tratamento adequado e monitoramento glicêmico regular em indivíduos assintomáticos, mas portadores da mutação, viabilizando um diagnóstico precoce de hiperglicemia e a tomada de decisões terapêuticas apropriadas. O impacto positivo da confirmação diagnóstica e da subsequente classificação do subtipo de MODY através da análise genética resulta em um tratamento individualizado e eficaz, melhorando a qualidade de vida do paciente.

O sequenciamento Sanger, apesar de ser uma técnica consagrada, apresenta limitações significativas no contexto do diagnóstico de MODY. O método, além de ser oneroso e demorado, enfrenta dificuldades decorrentes da grande diversidade genética da doença, com 14 genes diferentes descritos até o momento. A dificuldade se acentua pelo tamanho considerável de alguns genes, como o ABCC8 (39 éxons), e pela ausência de regiões gênicas com alta concentração de mutações (hotspots) na maioria dos genes. Essa ausência de hotspots exige o sequenciamento de todos os éxons do gene em questão, aumentando o tempo e os custos da análise. Na prática clínica rotineira, o sequenciamento Sanger costuma se concentrar nos dois genes mais prevalentes, GCK e HNF1A, a escolha baseada nas características clínicas do paciente. Os genes associados a formas mais raras de MODY são tipicamente excluídos da análise rotineira por Sanger, sendo incluídos apenas em situações de pesquisa, quando a suspeita clínica é forte e os genes mais comuns já foram testados e excluídos. Isso resulta em um número significativo de casos não-diagnosticados, classificados como MODY X.

Em contraste com o sequenciamento Sanger, o sequenciamento de nova geração (NGS), neste caso específico o Sequenciamento de Ligação em Alta Densidade (SLE), surge como uma estratégia promissora para superar as limitações da técnica tradicional. O SLE permite o sequenciamento simultâneo de diversos genes, acelerando o processo diagnóstico e tornando-o menos trabalhoso. Essa capacidade é particularmente vantajosa para doenças com grande heterogeneidade genética como a MODY, permitindo a investigação de subtipos mais raros, geralmente não estudados com Sanger. No Brasil, onde a taxa de casos não confirmados (MODY X) é alta, a aplicação do SLE se apresenta como uma abordagem custo-efetiva para expandir o diagnóstico molecular de MODY, melhorar a eficiência da análise genética e possibilitar a identificação de novas variantes e genes associados ao fenótipo da doença. A possibilidade de avaliar simultaneamente múltiplos genes associados a diferentes tipos de diabetes monogênico, incluindo genes de MODY e genes relacionados a outras formas de diabetes, torna o NGS uma abordagem mais abrangente e eficaz do que o Sanger.

O painel de Sequenciamento de Ligação em Alta Densidade (SLE) permitiu a confirmação do diagnóstico genético de MODY em 20% (16/80) dos casos avaliados. Excluindo os 5 falsos negativos atribuídos ao método Sanger (taxa de erro de aproximadamente 6%, similar à taxa de erro do Sanger estimada em 7%), a positividade do painel cai para 14%. Considerando os 15 casos com variantes de significado incerto, que poderiam ser reclassificados como patogênicos com evidências adicionais, a positividade poderia alcançar 39%. Foram identificadas 16 variantes patogênicas/provavelmente patogênicas: 6 no gene GCK, 1 em HNF1A, 1 em HNF4A, 1 em HNF1B, 6 em genes de MODY considerados raros (habitualmente não sequenciados em rotina de Sanger), e 1 em um gene associado apenas a diabetes neonatal. Todas as variantes em GCK já haviam sido associadas a MODY em diferentes populações. A não detecção de 6 variantes na análise prévia por Sanger se deu por falsos negativos (3 devido ao fenômeno de 'allelic dropout' e 1 por erro na leitura do eletroferograma) e por erros na hipótese clínica inicial (2 casos com bom controle glicêmico com sulfoniluréia, inicialmente diagnosticados como MODY-HNF1A). A investigação adicional, após o resultado do SLE, em um paciente com variante em HNF1B, revelou agenesia de corpo e cauda de pâncreas e pequeno cisto renal, compatíveis com o fenótipo MODY-HNF1B.

A discussão compara a performance do painel de SLE com outros estudos internacionais. Estudos similares que avaliaram pacientes com resultados Sanger negativos reportaram positividades entre 11% e 33% utilizando painéis de NGS com menor número de genes. Este estudo, o primeiro a avaliar pacientes com suspeita de MODY no Brasil usando um painel com 51 genes, demonstrou performance similar. A discussão considera a classificação das variantes de significado incerto segundo as diretrizes da ACMG, enfatizando a necessidade de evidências adicionais para reclassificação (dados de segregação familiar, recorrência da variante em outras famílias, e estudos funcionais). Foram descritas as características de algumas variantes específicas, incluindo sua frequência alélica em bancos de dados como GnomAD e ABraOM e predições in silico. A análise dessas variantes inclui dados sobre MAF (frequência alélica menor), predições deletérias em alguns programas in silico e estudos funcionais disponíveis na literatura. A complexidade de definir a patogenicidade de uma variante genética é ressaltada, reconhecendo-se as limitações dos modelos animais para validação funcional e a variabilidade fenotípica mesmo dentro de uma mesma família. A presença de variantes em genes de MODY raros permitiu a ampliação da casuística destes subtipos, porém, a variabilidade fenotípica dificulta a definição de um quadro clínico típico.

O estudo conclui que o painel de SLE ampliou significativamente o número de casos de MODY confirmados no Brasil, contribuindo para a redução de casos MODY X. A detecção de variantes em genes de MODY raros expandiu a casuística desses subtipos, embora a variabilidade fenotípica dificulte a definição de padrões clínicos-laboratoriais típicos e de resposta terapêutica. A identificação de variantes novas em genes previamente associados apenas a diabetes neonatal ressalta a necessidade de mais estudos para confirmar a associação com MODY. O NGS se mostrou promissor para elucidar a base genética da MODY, revelando novas variantes em genes conhecidos (HNF4A e NEUROD1) e variantes alélicas em novos genes (como NEUROG3, e variantes de significado incerto em RFX6, GLIS3, CP e SLC19A2). A pesquisa destaca a necessidade de mais estudos com SLE para uma melhor caracterização dos casos de MODY, especialmente aqueles relacionados a genes raros e a variantes de significado incerto. Os resultados reforçam a importância do NGS como ferramenta crucial para o diagnóstico preciso e completo da MODY, melhorando o tratamento e o aconselhamento genético.

O estudo foi conduzido seguindo rigorosamente os princípios éticos e as orientações da Declaração de Helsinki e da Portaria 196/96 do Conselho Nacional de Saúde. Foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) sob o número #70637. Antes do início da pesquisa genética, foi obtido consentimento informado por escrito de todos os pacientes maiores de 18 anos ou de seus pais/tutores, assim como de todos os familiares que participaram do estudo. Esse comprometimento com a ética garante a proteção dos participantes da pesquisa e a observância dos padrões éticos para a realização de estudos científicos envolvendo seres humanos. A transparência e o respeito aos direitos dos participantes são assegurados pela obtenção do consentimento informado, permitindo que os indivíduos tomem decisões conscientes sobre sua participação na pesquisa. A aprovação do projeto pela CAPPesq demonstra o compromisso da equipe de pesquisa com a conduta ética e o cumprimento de todos os requisitos regulatórios para a pesquisa em seres humanos.

Um total de 152 pacientes com suspeita clínica de MODY foram inicialmente referenciados para o estudo molecular. Após a aplicação dos critérios de inclusão, 15 pacientes foram excluídos, resultando em 137 casos para análise. Destes, 88% eram provenientes de um estudo prévio desenvolvido pelo grupo de pesquisa em Diabetes Monogênico da USP e 12% de investigações genéticas prévias negativas realizadas no Laboratório de Endocrinologia Molecular e Translacional da Universidade Federal de São Paulo. Os 137 casos restantes foram avaliados inicialmente pelo método de sequenciamento Sanger, com sequenciamento de todos os éxons de um dos dois genes alvo (GCK ou HNF1A), sendo a escolha baseada no fenótipo clínico. Pacientes com resultado negativo em Sanger foram selecionados para o estudo utilizando NGS (painel de SLE). A extração do DNA genômico foi realizada a partir de leucócitos de sangue periférico, utilizando um procedimento padronizado no Laboratório de Endocrinologia Molecular e Celular - LIM25, FMUSP. A concentração e integridade do DNA foram verificadas por espectrofotometria e eletroforese em gel de agarose. Todas as amostras foram congeladas e estocadas a -20°C. O painel de SLE customizado incluiu 51 genes associados a diferentes tipos de diabetes monogênico, abrangendo genes de MODY, diabetes neonatal, diabetes autoimune, síndrome de Wolfram, resistência à insulina, lipodistrofia e hiperinsulinismo hiperinsulinêmica familiar (HHF).

A análise dos dados gerados pelo SLE considerou todos os genes potencialmente associados ao fenótipo do paciente, priorizando os 14 genes previamente associados à MODY. Nos casos sem variantes patogênicas nesses genes, foram analisados genes candidatos relacionados a diabetes neonatal e HHF. As variantes alélicas relevantes identificadas por SLE (mutações pontuais ou pequenas indels) foram confirmadas pela técnica de Sanger, focando apenas na região gênica específica onde a mutação foi encontrada. O sequenciamento Sanger se baseou na amplificação da região codificadora do gene alvo usando primers intrônicos e PCR, com controle negativo. Os produtos da PCR foram purificados e a reação de sequenciamento realizada usando o kit BigDye Terminator v3.1. A análise dos eletroferogramas foi realizada usando o software Sequencher. A avaliação da patogenicidade das variantes considerou a frequência alélica em bancos de dados populacionais (GnomAD, ABraOM), predições in silico e estudos de co-segregação familiar. A comparação com estudos prévios e a discussão sobre as limitações da análise, incluindo a interpretação de variantes de significado incerto e a necessidade de estudos funcionais adicionais, são aspectos importantes.