Melanomacrófagos em Peixes: Poluentes

O estudo iniciou com a avaliação de diferentes técnicas de coloração para a visualização de agregados de macrófagos pigmentados (AMPs) em amostras de fígado de peixe. Foram testadas a hematoxilina e eosina (H&E), Masson-Fontana, Azul da Prússia de Perl e a reação periódica de ácido Schiff (PAS), combinada com hematoxilina. A análise microscópica dessas colorações revelou que a H&E ofereceu um contraste muito fraco entre os AMPs e o parênquima hepático, tornando-a inadequada para análise de imagem, que necessita de bom contraste para quantificação. A coloração PAS, por outro lado, demonstrou-se eficiente e simples, permitindo a visualização clara dos AMPs em tom rosa intenso, contrastando com o parênquima azulado. A coloração PAS foi selecionada por sua confiabilidade na coloração dos AMPs e facilidade de visualização. Outros métodos se mostraram menos eficazes ou mais complexos.

Após a seleção da coloração PAS, a pesquisa prosseguiu avaliando diferentes soluções fixadoras para a preservação tecidual e integridade dos AMPs. Formol neutro tamponado a 10%, solução de Davidson e paraformaldeído foram testados e comparados com a solução de Bouin. A fixação com formol a 10% resultou em imagens com pouca preservação dos tecidos, apresentando-se inadequada para análises morfométricas. A solução de Davidson também se mostrou inadequada, causando rompimentos extensos nas seções. Embora o paraformaldeído tenha oferecido boa preservação, os AMPs apresentaram-se fragmentados, com macrófagos dissociados. Em contrapartida, a solução de Bouin garantiu excelentes resultados, preservando a integridade dos AMPs e a estrutura tecidual, sem rompimentos artificiais. Portanto, a solução de Bouin foi escolhida como a melhor solução fixadora para as análises subsequentes, por sua superioridade em preservar a integridade dos AMPs e a estrutura tecidual, ideal para estudos quantitativos e imagens.

O estudo investigou a influência do sexo na quantidade de agregados de macrófagos pigmentados (AMPs) em fígado de Xiphophorus maculatus. Resultados de análises estatísticas, utilizando ANOVA e testes pós-hoc (Tukey e Newman-Keuls), revelaram diferenças significativas entre os sexos. Independentemente da temperatura (22°C ou 28°C), as fêmeas apresentaram consistentemente um número significativamente maior de AMPs, indicando que o sexo é um fator determinante na quantidade desses agregados no fígado. Essa descoberta corrobora a hipótese inicial de que os AMPs podem ser modulados por fatores endógenos, possivelmente hormônios sexuais. A análise incluiu diferentes parâmetros como volume hepático, volume relativo de AMPs, volume absoluto de AMPs e volume ponderado por volume, todos demonstrando diferenças significativas entre machos e fêmeas em pelo menos um dos parâmetros, validando a influência do sexo na quantidade de AMPs. A alta variabilidade nos dados, porém, ressalta a complexidade da relação entre sexo, temperatura e a quantidade de AMPs.

A pesquisa também avaliou o impacto da temperatura (22°C e 28°C) na quantidade de AMPs no fígado dos peixes. A análise estatística mostrou uma relação complexa entre temperatura e quantidade de AMPs, com interação com o fator sexo. Embora houvesse uma tendência para maiores volumes hepáticos em temperaturas mais baixas (22°C), a diferença só foi estatisticamente significativa quando os sexos foram agrupados. Análises adicionais, incluindo o volume absoluto de AMPs, revelaram três conjuntos estatísticos distintos, mostrando que a temperatura, sozinha ou em interação com o sexo, afeta a quantidade de AMPs. Em altas temperaturas, as fêmeas apresentaram a maior quantidade de AMPs, sugerindo uma possível relação com níveis mais elevados de estrógenos, hormônios tipicamente mais presentes em fêmeas em temperatura ideal para reprodução. A análise de volume ponderado por volume também evidenciou diferenças entre os sexos, indicando que a maior quantidade de AMPs nas fêmeas provavelmente se deve a um aumento no número de agregados, e não ao aumento no volume individual de cada AMP.

Para avaliar a atividade dos AMPs, a pesquisa utilizou a saturação de cor da coloração histoquímica para fosfatase ácida (AP) como um proxy. Em baixas temperaturas, as fêmeas apresentaram maior saturação de cor (e consequentemente maior atividade de AP) do que os machos, indicando maior atividade enzimática associada aos AMPs nas fêmeas. Em altas temperaturas, no entanto, não houve diferença significativa entre os sexos, apesar da tendência das fêmeas apresentarem maior conteúdo hepático de AMPs. Esta discrepância pode ser atribuída a uma possível correlação negativa entre a atividade de AP e hormônios estrogênicos, como descrito em estudos anteriores com soro de camundongos. A atividade de AP, portanto, se mostrou sensível à influência da temperatura, mas principalmente ao sexo e sua interação com a temperatura, indicando que a atividade dos macrófagos está fortemente ligada a fatores fisiológicos endógenos do animal. Os resultados reforçam a complexidade da relação entre sexo, temperatura, quantidade e atividade de AMPs.

Um segundo experimento foi realizado para avaliar o efeito do 17α-etinilestradiol (EE2), um xenoestrogênio, sobre os agregados de macrófagos pigmentados (AMPs) em fígado de Xiphophorus maculatus. Machos foram expostos a 75 ng/L de EE2 por 21 dias. A análise dos dados, utilizando métodos estereológicos para quantificar os AMPs, não revelou diferenças significativas nos parâmetros morfológicos (volume, volume relativo, volume total e volume ponderado por volume) entre os grupos controle e expostos ao EE2. Apesar de uma tendência sugestiva para valores médios maiores nos animais expostos, esta diferença não foi estatisticamente significativa, indicando que, sob as condições testadas, a exposição subcrônica ao EE2 não causou alterações detectáveis na morfologia dos AMPs no fígado dos peixes. A alta variabilidade observada nos dados, similar àquela encontrada no experimento com variação de temperatura e sexo, sugere que a utilização de tais parâmetros em abordagens de biomarcadores pode ser afetada por essa variabilidade e necessita de estudos com amostras maiores.

Além dos parâmetros morfológicos, a pesquisa também investigou o efeito da exposição ao EE2 na atividade da fosfatase ácida (AP) nos AMPs, utilizando análise de imagem após coloração histoquímica específica para AP. Ao contrário dos parâmetros morfológicos, observou-se uma redução sistemática, embora não estatisticamente significativa, no sinal histoquímico (saturação de cor) nos AMPs dos animais expostos ao EE2 em comparação com o grupo controle. Essa diminuição na atividade enzimática sugere uma possível interferência do EE2 na função dos macrófagos, que é dependente da atividade da AP. A falta de significância estatística pode ser devido ao tamanho da amostra ou à alta variabilidade intrínseca da atividade enzimática. Apesar disso, a tendência observada indica que a atividade da AP nos AMPs pode ser um indicador mais sensível aos efeitos do EE2 do que os parâmetros morfológicos, requerendo mais investigação com amostras maiores para confirmar esta hipótese.

Para investigar potenciais efeitos fisiológicos basais do EE2, foi realizada uma análise de imunohistoquímica para vitelogenina (Vtg) em hepatócitos. Um método indireto em duas etapas foi empregado, utilizando um controle positivo com fígado de zebrafish para validar o anticorpo. No entanto, tanto os animais controle quanto os expostos ao EE2 não mostraram marcação positiva para Vtg, sugerindo duas possibilidades: ausência de expressão de Vtg ou falta de afinidade do anticorpo primário para o fígado de Xiphophorus maculatus. A análise de lâminas coradas com H&E indicou aumento na basofilia tecidual nos animais expostos ao EE2, atribuível a um aumento no retículo endoplasmático rugoso (RER). Este resultado, aliado à conhecida indução de expressão de Vtg pela exposição ao EE2 em outras espécies, sugere que a falta de marcação de Vtg se deve à falta de afinidade do anticorpo utilizado e não à ausência de resposta do fígado à exposição ao EE2.

A metodologia empregada envolveu a eutanásia dos peixes por secção da medula espinhal após administração de anestésico (fenoxietanol). Em seguida, foram medidas a massa corporal e o comprimento dos peixes, e os fígados e gônadas foram dissecados e pesados. O fígado foi seccionado em duas metades: uma para análise de microscopia de luz e a outra para ensaios de histoquímica enzimática. As amostras para microscopia de luz foram fixadas em solução de Bouin por 24 horas, seguida de etanol 70%, enquanto as amostras para histoquímica (visando a atividade da fosfatase ácida - AP) foram encapsuladas em meio OCT, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70°C. Para a microscopia de luz, as amostras foram desidratadas, clarificadas em xileno, infiltradas e incluídas em parafina. Cortes de 5 µm de espessura foram obtidos em micrótomo automático Leica 2155, com espaçamento entre secções variando de acordo com o tamanho da amostra. Algumas secções foram coradas com H&E, enquanto a maioria foi corada com PAS e contracorada com hematoxilina para análise de AMPs. A preparação das amostras seguiu os protocolos para garantir a qualidade das análises microscópicas, optimizando a visualização dos AMPs.

Para a detecção de açúcares presentes na lipofuscina, utilizou-se a reação periódica de ácido Schiff (PAS), contracorada com hematoxilina. Para a quantificação da atividade da fosfatase ácida (AP) nos AMPs, utilizou-se uma coloração enzimática específica, com incubação das secções em solução contendo o substrato (naftol AS-BI fosfato), solução tampão (acetato de sódio e solução aquosa de barbital), nitrito de sódio e pararosanilina. O tempo ideal de incubação foi determinado em experimentos preliminares (5 minutos). A imunohistoquímica para vitelogenina (Vtg) foi realizada utilizando um método indireto em duas etapas, com recuperação antigênica por microondas e bloqueamento da peroxidase endógena. Foram utilizadas soluções de bloqueio de ligação não-específica e tampão PBS. Um controle positivo (fígado de zebrafish) foi incluído. As técnicas histoquímicas e de imunohistoquímica permitiram analisar a quantidade e a atividade dos AMPs, além de avaliar a possível influência do EE2 sobre a expressão de Vtg, servindo como proxy para o efeito endócrino do EE2.

A análise estatística foi realizada utilizando o software IBM SPSS Statistics 19. Para o primeiro ensaio (efeito de sexo e temperatura), foram realizadas análises descritivas dos dados, verificando a normalidade e aplicando transformações logarítmicas (base 10) quando necessário. Análises de variância (ANOVA) com nível de confiança de 95% foram realizadas, seguidas de testes pós-hoc de Tukey e Newman-Keuls para comparação entre grupos. Resultados marginalmente significativos foram considerados em caso de discrepância entre os dois testes pós-hoc. Esta estratégia permitiu uma melhor interpretação biológica dos dados. Para a análise do segundo ensaio (exposição ao EE2), os dados foram analisados de forma semelhante, empregando ANOVA e testes pós-hoc, buscando diferenças significativas entre os grupos controle e expostos. A utilização do software SPSS e de diferentes testes estatísticos permitiu uma análise robusta e completa dos dados coletados.

O estudo validou um método estereológico imparcial e quantitativo para avaliar alterações relacionadas ao volume de agregados de macrófagos pigmentados (AMPs) em nível histopatológico. Este método, aplicável em ensaios experimentais e de biomonitoramento, utilizou contagem diferencial de pontos, interceptos amostrados por pontos e o estimador de Cavalieri. A combinação da fixação com solução de Bouin e a coloração PAS se mostrou ideal, garantindo resultados precisos e rápidos na quantificação de alterações nos AMPs. Este método fornece uma abordagem teoricamente sólida e relativamente simples para estudos quantitativos de histopatologia em AMPs de fígado de peixe, superando as limitações de métodos anteriores e permitindo uma análise mais objetiva e eficiente das alterações morfológicas dos AMPs.

Os resultados demonstraram a modulação dos AMPs hepáticos pelo sexo do peixe, indicando um possível controle hormonal endógeno. As fêmeas apresentaram consistentemente maior quantidade de AMPs, que também eram maiores que os dos machos, independentemente da temperatura testada. Embora a temperatura tenha apresentado algum efeito, este foi menos consistente que o efeito do sexo. A influência do sexo na quantidade e tamanho dos AMPs aponta para uma possível regulação hormonal endógena, provavelmente envolvendo esteroides sexuais. Esta descoberta tem importantes implicações para estudos futuros que utilizam os AMPs como biomarcadores, destacando a necessidade de controlar e considerar este fator.

A exposição subcrônica dos machos de Xiphophorus maculatus ao 17α-etinilestradiol (EE2) não resultou em alterações nos parâmetros morfológicos dos AMPs, indicando que, sob as condições testadas, os AMPs podem não ser biomarcadores adequados para contaminação por xenoestrogênios em situações subagudas. Embora uma redução na atividade da fosfatase ácida (AP) nos AMPs tenha sido observada após a exposição ao EE2, esta alteração não foi estatisticamente significativa. Isto indica a necessidade de mais estudos com amostras maiores para avaliar a sensibilidade da atividade de AP como biomarcador. A alta variabilidade intrínseca dos parâmetros dos AMPs deve ser considerada, sugerindo a necessidade de amostras maiores para detectar diferenças sutis. O estudo ressalta a importância de controlar o efeito do sexo para evitar viés em estudos que utilizam AMPs como biomarcadores ambientais. A análise de vitelogenina (Vtg) não forneceu dados relevantes devido à falta de afinidade do anticorpo utilizado, o que não compromete as outras descobertas.