TCE: Canais Iônicos e Estresse Oxidativo

O estudo utilizou ratos machos da estirpe Wistar-Hannover, obtidos da Harlan Ibérica (Barcelona, Espanha), com peso entre 340 e 400g. Os animais foram alojados em ambiente com temperatura controlada a 21°C e ciclo de luz/escuro de 12 horas, com acesso ad libitum a água e ração Teklad Global 16%. Estas condições padronizadas são essenciais para garantir a reprodutibilidade dos resultados e minimizar a variabilidade entre os animais, assegurando que as diferenças observadas sejam atribuíveis à indução do traumatismo cranioencefálico e não a fatores ambientais. A escolha da linhagem Wistar-Hannover é baseada em sua ampla utilização em estudos pré-clínicos, facilitando a comparação com outros trabalhos. O controle rigoroso de peso também minimiza a variabilidade fisiológica que poderia influenciar os resultados do experimento. O acesso livre a água e comida garante o bem-estar animal e condições fisiológicas estáveis durante todo o estudo. A utilização de ração padronizada garante a consistência nutricional entre os animais, evitando variações que poderiam afetar a resposta ao trauma.

O modelo experimental de traumatismo cranioencefálico (TCE) utilizado foi baseado no método de Marmarou e colaboradores, um modelo de TCE fechado que protege o crânio de fraturas. Após a anestesia, realizou-se uma incisão na linha média do crânio, expondo o vértice após a remoção do periósteo. Um disco metálico foi fixado entre as suturas coronal e lambdóide do crânio. O animal, em pronação, foi colocado sobre uma esponja de constante elástica conhecida dentro de uma caixa de acrílico. Um tubo de plexiglass foi posicionado sobre o capacete, e a lesão foi induzida pela queda de um peso de 2 metros de altura. A caixa foi removida imediatamente após o impacto para evitar um segundo trauma. A respiração dos animais foi espontânea, sem intubação traqueal. A escolha do modelo de Marmarou permite a indução de lesão axonal difusa, similar à observada em humanos, sem a presença de lesões focais. A metodologia rigorosa, com o controle da altura da queda do peso e a remoção imediata da caixa após o impacto, visa minimizar a variabilidade da lesão e garantir a reprodutibilidade do modelo, crucial para a validade dos resultados experimentais. O critério dos autores do modelo foi a gravidade do traumatismo, resultando em mortalidade de aproximadamente 50%.

Uma das principais metodologias empregadas para avaliar a lesão axonal difusa (LAD) neste estudo foi a coloração do tecido cerebral com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC). Esta técnica permite avaliar alterações no metabolismo mitocondrial, uma vez que a coloração com TTC depende da atividade da desidrogenase do succinato mitocondrial, que reduz o TTC a formazano, um composto vermelho. Áreas com metabolismo comprometido permanecem descoradas (brancas). A análise das imagens digitais permitiu quantificar a percentagem de tecido não corado, fornecendo uma medida indireta da extensão do dano mitocondrial associado à LAD. A escolha do TTC se deve a sua capacidade de fornecer uma avaliação rápida e objetiva do metabolismo, sendo uma alternativa a técnicas histológicas mais morosas. A escolha de 24 horas após o traumatismo para a análise reflete o momento em que a lesão axonal atinge sua máxima expressão, segundo estudos prévios, permitindo uma avaliação mais precisa do impacto do TCE e dos tratamentos administrados. Este método, embora indireto, oferece uma visão geral da integridade metabólica do tecido cerebral após o trauma, sendo um parâmetro crucial na avaliação da LAD.

Para complementar a análise metabólica, foi realizado um estudo ultraestrutural em zonas ricas em feixes axonais, especificamente o cíngulo. Este exame microscópico permitiu a observação direta de alterações ultraestruturais associadas à LAD, tais como a acumulação de organelos (como peroxissomas e mitocôndrias) e o edema mitocondrial. Essas alterações ultraestruturais são indicadores de disfunção axonal e são frequentemente observadas em casos de LAD. A análise microscópica detalhada fornece informações sobre as alterações morfológicas das estruturas celulares, complementando os dados obtidos através da coloração com TTC. A escolha do cíngulo como região de interesse se justifica pela sua alta densidade de feixes axonais, tornando-o uma região particularmente suscetível a danos na LAD. A observação dessas alterações ultraestruturais permitiu uma avaliação mais completa da gravidade da LAD e a eficácia dos tratamentos testados, oferecendo uma visão microscópica da resposta tecidual ao trauma.

A avaliação da resposta ao estresse oxidativo foi realizada através da medição da atividade de enzimas antioxidantes, como a catalase e a superóxido dismutase (SOD), tanto no sistema nervoso central quanto no sistema sistêmico (fígado e sangue). A peroxidação lipídica, um processo associado ao dano oxidativo, foi determinada através da quantificação de malonildialdeído (MDA), usando o método das substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS). A escolha da catalase e SOD se justifica pelo seu papel fundamental na proteção celular contra os danos causados por espécies reativas de oxigênio (EROs), geradas em abundância após o TCE. A avaliação da peroxidação lipídica, através da medição de MDA, fornece uma medida indireta do dano oxidativo sofrido pelas membranas celulares. A análise da atividade destas enzimas em diferentes tecidos (cérebro, fígado e sangue) permite uma avaliação mais completa da resposta sistêmica ao trauma. A combinação dessas análises fornece um quadro abrangente da resposta antioxidante do organismo ao trauma e do potencial efeito protetor dos fármacos.

Para avaliar os défices neurológicos resultantes do TCE, foi utilizado o teste do rotarod. Este teste avalia o desempenho motor dos animais, medindo a capacidade de permanecer em equilíbrio numa plataforma rotativa. A perda de equilíbrio e a queda precoce são indicadores de disfunção motora, relacionada com a lesão do sistema nervoso. A escolha do teste do rotarod é justificada por sua sensibilidade e eficiência na avaliação de défices motores em modelos de TCE. A análise do desempenho dos animais no rotarod permite correlacionar os défices motores observados com a gravidade da lesão cerebral induzida e avaliar o possível efeito protetor dos tratamentos administrados. A capacidade de realizar este teste é limitada pela forma de administração do gadolínio, não sendo possível sua avaliação neste grupo experimental, o que limitou a possibilidade de avaliar a influência deste composto na recuperação motora.

A análise da coloração com TTC, 24 horas após o traumatismo cranioencefálico (TCE), revelou uma diminuição significativa da área de tecido não corado (área branca) no grupo TCE (12,71% ± 1,45) comparado ao grupo controle (23,94% ± 2,26; p <0,05, Newman-Keuls). Este achado indica comprometimento do metabolismo mitocondrial após o TCE. No entanto, a administração de gadolínio (GAD) ou amilorida (AMI) 30 minutos após o trauma reverteu significativamente este efeito (TCEGAD: 21,47% ± 1,02; TCEAMI: 21,92% ± 2,51), indicando um efeito protetor desses fármacos sobre o metabolismo mitocondrial. A administração dos fármacos em animais controle não traumatizados não alterou significativamente a coloração (CONTGAD: 24,1% ± 1,98; CONTAMI: dados não apresentados), sugerindo que o efeito observado nos grupos com TCE se deve à ação dos fármacos sobre o dano induzido pelo trauma e não a um efeito direto independente do TCE. A reversão da diminuição da área de tecido corado pelo TTC após a administração de GAD e AMI sugere uma preservação ou recuperação da atividade metabólica mitocondrial, indicando um potencial efeito neuroprotetor desses compostos.

A avaliação da peroxidação lipídica, medida pela quantidade de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) 24 horas após o TCE, mostrou um aumento significativo no grupo TCE (26,81 nmol/g cérebro ± 2,19) em comparação com o grupo controle (18,25 nmol/g cérebro ± 1,25; p <0,05, Newman-Keuls). Este achado é consistente com a formação de espécies reativas de oxigênio após o trauma. O tratamento com GAD (13,41 nmol/g cérebro ± 1,80) ou AMI (17,48 nmol/g cérebro ± 1,77) reverteu esse aumento, demonstrando um efeito protetor contra o dano oxidativo. Interessantemente, a administração de GAD em animais controle não traumatizados levou a uma redução significativa na produção de TBARS (9,26 nmol/g cérebro ± 0,66; p <0,05, Newman-Keuls), enquanto a AMI não apresentou o mesmo efeito (17,54 nmol/g cérebro ± 1,77), indicando um possível efeito independente do TCE para o gadolínio na redução da peroxidação lipídica. Os resultados demonstram que ambos os fármacos reduzem a peroxidação lipídica induzida pelo TCE, sugerindo um mecanismo de neuroproteção.

A atividade da catalase, enzima antioxidante, apresentou aumento significativo até 6 horas pós-TCE, seguida de redução a níveis inferiores aos controles às 24 horas. Tanto GAD como AMI evitaram essa queda da atividade da catalase às 24 horas, indicando um efeito protetor. Em relação à superóxido dismutase (SOD), observou-se preservação da atividade hepática e sanguínea com a administração de GAD, enquanto o AMI manteve a atividade sanguínea. O teste do rotarod, para avaliar a função motora, mostrou que a administração de AMI impediu a perda de desempenho motora observada no grupo TCE, enquanto a administração de GAD não pôde ser avaliada neste teste devido à limitação na performance animal provocada pela sua administração. A análise conjunta desses parâmetros indica que ambos os compostos apresentam um efeito neuroprotetor, diminuindo o estresse oxidativo e mantendo, em diferentes níveis, a função motora, sendo que o amilorido demonstrou mais efeito neste caso.

Os resultados sugerem que a neuroproteção observada com a administração de gadolínio (GAD) e amilorida (AMI) após o traumatismo cranioencefálico (TCE) está relacionada à sua ação como bloqueadores de canais iônicos mecano-sensíveis. Esses canais, quando abertos devido ao trauma, permitem um influxo excessivo de íons, como sódio e cálcio, desencadeando uma cascata de eventos que levam à lesão celular e à lesão axonal difusa (LAD). Ao bloquear esses canais, o GAD e o AMI previnem ou reduzem esse influxo iônico, minimizando os efeitos deletérios subsequentes, como a peroxidação lipídica e o edema mitocondrial. A eficácia desses fármacos em preservar a atividade das enzimas antioxidantes (catalase e superóxido dismutase) suporta essa hipótese, demonstrando a redução do estresse oxidativo. A escolha desses fármacos baseou-se em estudos prévios que demonstraram o efeito protetor de bloqueadores de canais iônicos mecano-sensíveis no desenvolvimento do edema cerebral após TCE, o que justifica a sua utilização no presente estudo.

A discussão destaca a importância da mitocôndria na patogênese da LAD. A disfunção mitocondrial, evidenciada pela redução da coloração com TTC e alterações ultraestruturais (edema mitocondrial e acúmulo de organelas), contribui significativamente para a gravidade da lesão. O TCE causa desequilíbrio iônico intracelular, afetando a função mitocondrial e levando à redução do metabolismo energético e à produção de espécies reativas de oxigênio, resultando em estresse oxidativo. A proteção observada com GAD e AMI sobre os parâmetros mitocondriais sugere que a manutenção da função mitocondrial é crucial para atenuar os danos causados pelo TCE. A capacidade das mitocôndrias de atuarem como sumidouros de cálcio, em condições normais, e a subsequente sobrecarga de cálcio intramitocondrial que resulta em danos, inibe a síntese de ATP e liberta citocromo c, contribuindo para a lesão celular. A prevenção do edema mitocondrial por GAD e AMI, indica a proteção da função mitocondrial e destaca a importância do controle do desequilíbrio iônico intracelular na prevenção da lesão secundária.

O aumento da peroxidação lipídica observado no grupo TCE é consistente com a produção de espécies reativas de oxigênio após o trauma. A redução significativa da peroxidação lipídica observada nos grupos tratados com GAD e AMI reforça a ideia de que o controle desse processo é uma via importante para a neuroproteção. A capacidade de GAD em reduzir a produção de TBARS, mesmo em animais de controle sem TCE, sugere uma ação independente do trauma, possivelmente relacionada à inibição de células de Kupffer (no fígado) ou micróglia (no sistema nervoso central). A peroxidação lipídica causa danos às membranas celulares e contribui para a disfunção celular. A observação de que GAD e AMI reduzem a peroxidação lipídica, tanto no cérebro quanto no fígado, indica que o efeito protetor não se limita apenas ao tecido cerebral, mas reflete uma resposta sistêmica ao tratamento, com impacto benéfico em diferentes órgãos.

Este estudo demonstra o efeito neuroprotetor do gadolínio (GAD) e amilorida (AMI) em um modelo experimental de traumatismo cranioencefálico (TCE) em ratos. A administração desses fármacos 30 minutos após a indução do TCE resultou em significativa atenuação dos danos associados à lesão axonal difusa (LAD). A melhora observada em vários parâmetros, incluindo o metabolismo mitocondrial (avaliado pela coloração com TTC), a ultraestrutura de feixes axonais (redução de acúmulo de organelas e edema mitocondrial), a peroxidação lipídica (redução dos níveis de malonildialdeído) e a atividade de enzimas antioxidantes (catalase e superóxido dismutase), demonstra a eficácia dos compostos no combate aos mecanismos de lesão secundária após TCE. A preservação da função motora, observada particularmente com amilorida no teste do rotarod, reforça as evidências de neuroproteção.

A neuroproteção conferida por GAD e AMI provavelmente se deve à sua capacidade de bloquear canais iônicos mecano-sensíveis, regulando o influxo de cálcio e prevenindo o desequilíbrio iônico intracelular que desencadeia a cascata de eventos lesivos após o TCE. A preservação da atividade da catalase, uma enzima antioxidante crucial, indica a eficácia desses fármacos em atenuar o estresse oxidativo, característica marcante da lesão secundária. A manutenção da atividade mitocondrial sugere uma ação direta na proteção contra a disfunção dessas organelas fundamentais para o metabolismo energético celular. Esses resultados apontam para um potencial terapêutico de GAD e AMI no tratamento do TCE, reduzindo a gravidade da lesão e melhorando os resultados neurológicos. Entretanto, estudos adicionais são necessários para confirmar esses resultados e investigar a eficácia clínica desses compostos.

Embora os resultados sejam promissores, é importante considerar algumas limitações do estudo, como a ausência de avaliação da função motora no grupo tratado com GAD, devido à interferência do fármaco no teste do rotarod. A utilização de um modelo animal, embora fundamental para a pesquisa pré-clínica, não reproduz completamente a heterogeneidade da patologia em humanos. Portanto, estudos futuros devem focar na otimização dos protocolos de administração, na investigação de possíveis efeitos adversos e em ensaios clínicos para confirmar a eficácia e segurança de GAD e AMI em pacientes com TCE. A exploração de outros parâmetros, assim como a análise de diferentes tempos após a lesão, podem fornecer uma compreensão mais profunda dos mecanismos de ação e da janela terapêutica desses fármacos. A investigação continua crucial para o desenvolvimento de terapias eficazes para tratar o TCE, com potencial de melhora na recuperação neurológica dos pacientes.