Osteogênese: Células Mesenquimais e Látex

O documento inicia estabelecendo a crescente importância dos defeitos ósseos, diretamente ligada ao aumento da expectativa de vida e à maior prevalência de doenças crônicas na população. O envelhecimento populacional agrava essa situação, elevando a incidência de problemas ósseos. Essa introdução contextualiza a necessidade de novas abordagens terapêuticas, uma vez que os métodos convencionais se mostram insuficientes para lidar com a crescente demanda por tratamentos eficazes de regeneração óssea. A pesquisa destaca a urgência em se encontrar alternativas para os tratamentos atuais, que muitas vezes envolvem procedimentos cirúrgicos invasivos e complexos, com o objetivo de aprimorar o tratamento e a qualidade de vida dos pacientes acometidos por tais problemas.

O tratamento convencional para defeitos ósseos críticos, o transplante autólogo, embora considerado o padrão ouro, apresenta sérias limitações. O texto explicita que este método, baseado no transplante de tecido ósseo do próprio paciente, é extremamente invasivo, necessitando de uma cirurgia adicional para a retirada do enxerto. Além disso, o procedimento envolve um tempo prolongado de internação hospitalar, aumentando o risco de infecção e hematoma no local da cirurgia. A disponibilidade limitada de tecido ósseo autológo também é apontada como um fator restritivo para a utilização generalizada desta técnica, especialmente em casos de grandes defeitos ósseos. Essas desvantagens justificam a busca por alternativas de tratamento menos invasivas e mais eficazes para a regeneração óssea.

Como resposta às limitações dos tratamentos convencionais, a pesquisa propõe a utilização da engenharia de tecidos como uma alternativa promissora. A obtenção de tecidos saudáveis em laboratório, utilizando suportes tridimensionais porosos (scaffolds), é apresentada como uma estratégia inovadora para o crescimento e diferenciação celular. Os scaffolds atuam como um arcabouço para o desenvolvimento de novo tecido ósseo, sendo uma solução para a regeneração de ossos danificados. A otimização dos scaffolds, buscando uma vascularização adequada, é considerada crucial para o sucesso do processo de regeneração óssea. Essa abordagem menos invasiva representa uma esperança para o tratamento de defeitos ósseos críticos, superando as limitações impostas pelos métodos tradicionais.

A engenharia de tecidos se apresenta como uma abordagem promissora para a regeneração óssea, utilizando scaffolds tridimensionais porosos. Esses scaffolds, ou matrizes tridimensionais, atuam como um arcabouço, proporcionando um ambiente adequado para o crescimento e diferenciação de células tronco mesenquimais (CTMs). A capacidade de otimizar os scaffolds para garantir uma vascularização apropriada é destacada como um fator crítico para o sucesso da regeneração óssea, uma vez que um suprimento sanguíneo adequado é essencial para o desenvolvimento do novo tecido. A pesquisa se concentra no estudo de scaffolds, explorando sua capacidade de suporte ao crescimento e diferenciação celular, com o objetivo de acelerar e melhorar a regeneração óssea em casos de defeitos ósseos críticos.

O estudo se concentra na utilização de scaffolds de policaprolactona (PCL), um polímero biocompatível frequentemente empregado em engenharia de tecidos. A pesquisa investiga a potencial melhora das propriedades dos scaffolds de PCL através do reforço com grafeno, um material que tem demonstrado promissor potencial na área. A adição de grafeno aos scaffolds de PCL visa modular a proliferação e diferenciação celular, otimizando o processo de osteogênese. A escolha da policaprolactona como material base para os scaffolds se deve às suas propriedades biocompatíveis e biodegradáveis, adequadas para aplicações em engenharia de tecidos. O grafeno, por sua vez, contribui para a melhora das propriedades mecânicas e a condutividade do material, criando um substrato mais favorável para o crescimento e diferenciação óssea.

Os scaffolds de PCL e PCL/grafeno foram produzidos por meio de uma técnica de manufatura aditiva, um processo de fabricação camada a camada que permite um controle preciso na arquitetura dos scaffolds. A técnica de manufatura aditiva por extrusão possibilita a criação de scaffolds com geometria interna bem definida, distribuição uniforme de poros interconectados e propriedades mecânicas otimizadas. Esses parâmetros são cruciais para a viabilidade e proliferação celular, bem como para a diferenciação osteogênica. A avaliação in vitro dos scaffolds incluiu ensaios como MTT e vermelho de alizarina para determinar a viabilidade celular, a adesão e a diferenciação osteogênica. A metodologia aplicada buscava garantir a reprodutibilidade e a otimização da estrutura do scaffold para maximizar a sua eficácia na regeneração óssea.

O estudo utilizou células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) como principal elemento celular para a pesquisa. As ADSCs foram isoladas do tecido adiposo humano e, posteriormente, caracterizadas por imunofenotipagem e diferenciação in vitro. Esse processo de caracterização teve como objetivo validar a identidade e o potencial das células, garantindo que as ADSCs utilizadas possuíam as propriedades esperadas para o experimento. A imunofenotipagem confirmou o sucesso do isolamento e manutenção dessas células, demonstrando uma baixa porcentagem para marcadores negativos e uma alta porcentagem para marcadores positivos, corroborando com a literatura e indicando o sucesso da metodologia utilizada para o isolamento das células. A etapa de caracterização é fundamental para assegurar a qualidade e a confiabilidade dos resultados obtidos posteriormente nos ensaios in vitro e in vivo.

A capacidade de diferenciação in vitro das ADSCs foi avaliada através da mensuração da atividade da fosfatase alcalina (ALP), uma enzima utilizada como marcador precoce da diferenciação osteogênica. A atividade da ALP foi quantificada em diferentes tempos de cultivo, tanto em meio de cultura basal quanto em meio de cultura osteogênico. Essa análise permitiu observar a capacidade das ADSCs de se diferenciarem em osteoblastos em resposta ao meio de cultura osteogênico específico, uma etapa crucial para comprovar a funcionalidade das células. A utilização de um grupo controle, cultivado em meio basal, permitiu comparar a atividade enzimática e confirmar a influência do meio de cultura indutivo. Resultados positivos nesta etapa corroboraram com a capacidade das ADSCs de serem utilizadas na regeneração óssea.

Scaffolds de PCL, pré-colonizados e não colonizados com ADSCs, foram implantados em defeitos críticos de calvária em ratos para avaliar o potencial de osteointegração e osteoindução in vivo. A escolha do modelo de defeito crítico de calvária em ratos se justifica pela sua característica de osso membranoso e vascularização limitada, mimetizando melhor as condições de grandes perdas ósseas. A comparação entre grupos com scaffolds colonizados e não colonizados com ADSCs permitiu analisar a contribuição direta e indireta das ADSCs na formação óssea. A presença de marcadores anti-mitocondriais humanos no tecido ósseo dos animais que receberam os scaffolds colonizados confirmou a integração das células humanas ao tecido animal, demonstrando o potencial do xenotransplante. Os resultados in vivo complementam os resultados in vitro, validando a eficácia das ADSCs na regeneração óssea.

O estudo investigou a influência do pico proteico F1, extraído do látex da seringueira Hevea brasiliensis, na osteogênese. O F1 já havia demonstrado atividade angiogênica e cicatrizante em estudos anteriores, sendo essa uma propriedade relevante para a regeneração óssea, uma vez que a formação de novos vasos sanguíneos é essencial para o processo de cicatrização e regeneração tecidual. A pesquisa buscava aprofundar o conhecimento sobre o potencial do F1 como agente promotor da regeneração óssea, avaliando seus efeitos sobre a proliferação e diferenciação celular. Antes dos ensaios, foram realizados testes de endotoxinas para garantir a segurança e a pureza do F1, assegurando que os resultados obtidos não fossem influenciados por contaminantes que poderiam afetar o metabolismo celular.

A avaliação in vitro da atividade do pico F1 foi conduzida utilizando culturas de ADSCs e fibroblastos 3T3. Diversos ensaios foram realizados para avaliar a citotoxicidade (MTT), o potencial proliferativo (timidina-tritiada), a capacidade migratória (scratch assay) e a indução osteogênica (fosfatase alcalina). Em ensaios bidimensionais (2D), observou-se um estímulo proliferativo em concentrações baixas de F1 (0,00001% e 0,0001%), e maior porcentagem de migração celular também foi verificada em determinadas concentrações. Por outro lado, a diferenciação osteogênica, avaliada pela atividade da fosfatase alcalina, não foi significativamente estimulada pelo F1 em cultura 2D. Esses resultados in vitro indicaram a necessidade de estudos adicionais com outros modelos experimentais para avaliar o impacto do F1 na osteogênese.

Scaffolds de PCL, alguns reforçados com grafeno (PCL/grafeno), foram revestidos com o pico F1 por adsorção. A viabilidade/proliferação celular e a diferenciação osteogênica (fosfatase alcalina e vermelho de alizarina) nesses scaffolds foram então avaliadas. Os resultados mostraram um estímulo proliferativo em scaffolds colonizados com ADSCs, que foi ainda mais acentuado nos scaffolds de PCL/grafeno revestidos com F1, principalmente na concentração de 0,75% de grafeno. Embora a diferenciação osteogênica em cultura 2D não tenha sido significativamente aumentada pelo F1, observou-se aumento da atividade da fosfatase alcalina nos scaffolds revestidos, sugerindo um potencial sinérgico entre o F1 e o scaffold no contexto tridimensional. Esses resultados demonstram o potencial do F1, mesmo sem promover uma diferenciação osteogênica significativa em cultura 2D, quando combinado com scaffolds em um contexto tridimensional, indicando uma interação mais complexa e promissora para aplicações em engenharia tecidual.

Os scaffolds de policaprolactona (PCL), puros e reforçados com grafeno (PCL/grafeno), foram avaliados in vitro quanto à sua capacidade de promover adesão e viabilidade celular, bem como a diferenciação osteogênica. Ensaios de MTT e Alamar Blue foram utilizados para avaliar a viabilidade e proliferação celular, enquanto a coloração com vermelho de alizarina e a mensuração da atividade da fosfatase alcalina serviram para avaliar a diferenciação osteogênica. Os resultados in vitro mostraram que os scaffolds de PCL apresentaram não-toxicidade e foram capazes de induzir diferenciação osteogênica em resposta ao meio de cultura, demonstrando seu potencial como substrato para engenharia de tecidos. Scaffolds de PCL/grafeno, particularmente aqueles com concentrações menores de grafeno, demonstraram estimular a proliferação celular, sugerindo a compatibilidade do material com o crescimento celular. Essas avaliações in vitro forneceram dados essenciais para o planejamento dos experimentos in vivo.

Para avaliar o potencial in vivo dos scaffolds, utilizou-se um modelo experimental de defeito crítico de calvária em ratos. A calvária foi escolhida por sua composição de osso membranoso, com vascularização limitada, mimetizando grandes perdas ósseas que não se regeneram espontaneamente. Os animais foram divididos em quatro grupos: controle (sem scaffold), scaffold sem células, scaffold com ADSCs (células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano) e scaffold com ADSCs pré-diferenciadas em osteoblastos. Após oito semanas, as amostras de osso foram analisadas por histologia e imunohistoquímica. A análise histológica em aumento de 50x após 8 semanas do implante demonstrou que o grupo que recebeu scaffolds pré-colonizados com ADSCs humanas apresentou melhor formação óssea, indicando a efetividade deste método para a regeneração óssea. A técnica de imunoistoquímica ajudou a identificar a presença e a interação das células humanas no tecido do animal.

A análise histológica das amostras de calvária após oito semanas de implante revelou a formação de novo tecido ósseo nos grupos que receberam scaffolds, mostrando uma maior taxa de formação óssea no grupo que recebeu scaffolds colonizados com ADSCs humanas (SUC). Comparado com o grupo controle, os grupos com scaffolds apresentaram maior formação de tecido conjuntivo. A presença de um marcador anti-mitocondrial humano no grupo SUC sugere a integração e interação das ADSCs humanas com o tecido do rato, indicando a participação direta dessas células no processo de reparo ósseo. A ausência de inflamação nos quatro grupos estudados demonstra a biocompatibilidade dos materiais utilizados. Os resultados in vivo demonstraram o sucesso da estratégia de utilizar scaffolds de PCL colonizados com ADSCs para a regeneração óssea, com as células demonstrado ter capacidade de evadir a vigilância imunológica.

O trabalho conclui com sucesso a demonstração da eficácia do uso de células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) em conjunto com scaffolds para a regeneração óssea. Os resultados demonstram um desempenho superior dos scaffolds de policaprolactona (PCL) pré-colonizados com ADSCs, em comparação com scaffolds sem células ou com células previamente diferenciadas. Essa conclusão reforça a importância das células indiferenciadas no processo de regeneração, mesmo em casos de xenotransplante, contribuindo significativamente para a formação de novo tecido ósseo. A capacidade das ADSCs de evadir a vigilância imunológica, tanto imediatamente após o implante quanto em períodos mais longos, é um aspecto relevante para futuras aplicações clínicas, uma vez que aumenta a probabilidade de sucesso em transplantes.

O estudo identificou dois produtos promissores para a área de engenharia de tecidos: scaffolds de PCL com reforço de grafeno em baixas concentrações e a proteína F1 do látex de Hevea brasiliensis. Os scaffolds de PCL/grafeno demonstraram estimular a proliferação celular, efeito ainda mais acentuado quando combinados com o F1. Embora o F1 não tenha demonstrado aumento significativo na diferenciação osteogênica em cultura 2D, sua utilização em scaffolds tridimensionais mostrou aumento da atividade de fosfatase alcalina, indicando uma potencial sinergia no processo de osteogênese. A pesquisa destaca a importância da otimização da arquitetura do scaffold, com tamanhos de poros apropriados para a proliferação, diferenciação e vascularização adequadas. Esses resultados indicam que o uso conjunto desses materiais representa uma abordagem viável para a regeneração óssea, principalmente em pacientes idosos, onde a função celular pode estar comprometida.

A pesquisa considera a aplicabilidade dos resultados em tratamentos clínicos, especialmente em pacientes idosos, cuja capacidade de regeneração óssea é frequentemente reduzida. A idade dependente da proliferação e diferenciação das células tronco mesenquimais (CTMs) é mencionada como um fator a ser considerado. A utilização de scaffolds pré-colonizados com ADSCs humanas, mesmo em um cenário de xenotransplante, demonstra ser uma estratégia benéfica, superando as limitações dos enxertos autólogos, principalmente em termos de disponibilidade e invasividade. Os resultados sugerem que o uso de scaffolds, juntamente com ADSCs, pode ser uma solução promissora para o tratamento de defeitos ósseos críticos em pacientes idosos, que necessitam de abordagens menos invasivas e que consigam lidar com as limitações impostas pelo envelhecimento do paciente.