Aldeídos Bioindicadores: Microextração em Urinas

O resumo inicia abordando a importância da busca por uma vida saudável e a longevidade, contrastando com a realidade do câncer, especialmente o câncer de pulmão. Este tipo de câncer, um dos principais causadores de mortalidade em nível mundial, muitas vezes apresenta sintomas apenas em estágios avançados, dificultando o diagnóstico precoce e o tratamento eficaz. O texto destaca a necessidade de métodos de detecção precoce para melhorar as chances de recuperação. A alta incidência do câncer de pulmão é mencionada, com dados que apontam o tabagismo como a principal causa, além de outros fatores como inalação de poeira e poluição atmosférica, fumo passivo e predisposição genética. A dificuldade no diagnóstico precoce, devido à ausência de sintomas iniciais, reforça a necessidade de métodos de detecção mais eficazes, conduzindo à proposta de pesquisa apresentada no trabalho.

O objetivo principal do estudo é desenvolver um procedimento eficiente para o preparo de amostras e a extração de hexanal e heptanal em amostras de urina humana. Esses dois aldeídos são apresentados como biomarcadores potenciais para o diagnóstico precoce do câncer de pulmão. Para atingir esse objetivo, o trabalho propõe a utilização de uma metodologia que integra a técnica de microextração adsortiva em barra (BAµE) com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-DAD) como técnicas de separação e detecção dos compostos. A BAµE utiliza cortiça como material sorvente, o que contribui para a sustentabilidade do método. A pesquisa justifica a escolha do método pela sua capacidade de superar as limitações de outras técnicas, principalmente no que diz respeito à extração de compostos voláteis e pouco estáveis, como os aldeídos.

A metodologia proposta apresenta uma inovação no processo de microextração adsortiva em barra (BAµE). O trabalho propõe a impregnação do derivatizante 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) na barra adsortiva, que contém um material biossorvente. O uso de cortiça, um material natural, renovável e biodegradável, como fase extratora na BAµE, representa um avanço significativo, sendo destacada a sua sustentabilidade ambiental e disponibilidade a partir do descarte de rolhas de vinho. A pesquisa descreve o preparo da cortiça, incluindo o uso de lixa e peneira, visando otimizar a sua utilização como fase extratora. O processo de impregnação do DNPH é detalhado, assim como a utilização de equipamentos como o agitador Vortex e o aparelho de ultrassom para as etapas de condicionamento e dessorção da barra adsortiva. A água utilizada nos experimentos foi purificada usando um aparelho Mega purity (Billerica, EUA).

Esta seção discute os resultados obtidos na otimização do método proposto, incluindo a otimização do pH da extração e a escolha do solvente de dessorção. A escolha do pH ideal foi baseada na análise de resultados obtidos em diferentes valores de pH (4,0 e 4,8), utilizando soluções tampão de ácido cítrico/fosfato dissódico. A otimização do solvente de dessorção foi realizada utilizando um planejamento de superfície triangular, com acetonitrila, água ultrapura e metanol sendo testados. Os resultados cromatográficos obtidos com HPLC-DAD são analisados, enfatizando os tempos de retenção de hexanal e heptanal e a importância da derivatização para a detecção. O trabalho menciona a ocorrência de picos duplicados devido à formação de isômeros E e Z na reação de derivatização. A proposta de um novo design para a haste da barra adsortiva na técnica BAµE é apresentada como solução para problemas de baixa flutuação e rotação da barra durante a extração, buscando otimizar a adsorção dos analitos.

A seção descreve detalhadamente os materiais e reagentes utilizados no estudo. Padrões analíticos de hexanal e heptanal foram adquiridos da Sigma-Aldrich, com soluções estoque preparadas em metanol (J.T. Baker). Um padrão analítico de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) também foi obtido da Sigma-Aldrich, com soluções estoque e de trabalho preparadas em acetonitrila (J.T. Baker). Para a preparação da solução tampão, foram utilizados fosfato de sódio dibásico e ácido cítrico (Vetec, Brasil). A cortiça, proveniente de rolhas de vinho, foi preparada usando lixa para madeira e uma peneira de granulometria de 200 mesh. Outros materiais incluem frascos de 22 mL com tampa, um aparelho de ultrassom (Ultrasomik), um agitador Vortex (modelo EEQ9033, Edutec), e um aparelho de purificação de água Mega purity (Billerica, EUA). A descrição detalhada dos reagentes e equipamentos utilizados garante a reprodutibilidade do método.

A metodologia centraliza-se na técnica de microextração adsortiva em barra (BAµE), com uma inovação proposta: a impregnação inédita do derivatizante DNPH na barra adsortiva antes da extração. Essa impregnação é realizada em um eppendorf de 1 mL contendo uma mistura de DNPH e solução tampão, sob agitação em Vortex por 2 minutos. A otimização da técnica BAµE é crucial, focando na otimização do pH da extração. Soluções tampão de ácido cítrico/fosfato dissódico com pH 4,0 e 4,8 foram testadas, em um tempo de extração de 45 minutos, com uma razão molar DNPH:aldeídos de 40:1 e um tempo de dessorção de 20 minutos em acetonitrila. Parâmetros como tempo de extração, pH da amostra, força iônica e velocidade de agitação são mencionados como passíveis de otimização em estudos univariados ou multivariados. O método também inclui um novo design de haste para a barra adsortiva que visa melhorar a eficiência da extração.

A separação e detecção dos analitos (hexanal e heptanal) são realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (HPLC-DAD). O sistema HPLC utilizado é descrito, incluindo as características da coluna C18 (Thermo, 250 mm x 4,6 mm, tamanho de partícula de 5 µm), o fluxo da fase móvel (1 mL/min em modo isocrático), e os solventes utilizados (acetonitrila:água (88:12)). Os comprimentos de onda monitorados são 290 e 360 nm. O texto descreve experimentos iniciais com diferentes concentrações dos aldeídos (200 e 500 mg/L) para determinar os tempos de retenção. Observa-se que a derivatização é fundamental para a detecção dos aldeídos por HPLC-DAD, devido à sua alta volatilidade, reatividade e baixa estabilidade. A otimização da fase móvel é discutida, visando a coelução dos estereoisômeros E e Z formados na reação de derivatização, simplificando a análise cromatográfica. A escolha da fase móvel acetonitrila:água (88:12) é justificada após otimização.

A otimização do pH da extração foi investigada utilizando soluções tampão de ácido cítrico/fosfato dissódico em pH 4,0 e 4,8. O tempo de extração foi mantido constante em 45 minutos, com uma razão molar DNPH:aldeídos de 40:1 e um tempo de dessorção de 20 minutos em acetonitrila. A análise dos resultados (Figura 24, não apresentada aqui) indicou que ambos os pHs forneceram boas áreas para os analitos, mas o pH 4,0 apresentou menores erros. Conforme estudos de Liu et al., a adição de 2 mL de solução tampão de pH 4,0 resulta em um pH final da amostra próximo a 4,8, justificando a escolha do pH 4,0 para as extrações subsequentes. A escolha do pH ótimo é fundamental para a eficiência da reação de derivatização dos aldeídos com DNPH, que é acelerada em condições ácidas.

A otimização do solvente de dessorção utilizou um planejamento de superfície triangular, resultando em uma função quadrática com R² de 0,9073. Os solventes testados foram acetonitrila, água ultrapura e metanol. A melhor resposta foi obtida com 100% de acetonitrila (Figura 25, não apresentada aqui), uma escolha consistente com estudos prévios de Liu et al. A escolha do solvente ideal para a dessorção é crucial para garantir a máxima recuperação dos analitos da barra adsortiva e sua transferência para o sistema de HPLC-DAD, maximizando a sensibilidade e precisão da análise.

A análise dos cromatogramas obtidos após a otimização da fase móvel (Figura 21, não apresentada aqui) indica a eficácia do método. A ausência de picos em tempos de retenção específicos (5,34 min e 6,05 min) demonstra a seletividade da barra adsortiva para os analitos de interesse após a derivatização. A comparação com cromatogramas obtidos anteriormente (Figuras 16 e 17, não apresentadas aqui) confirma que os picos duplicados observados inicialmente eram devidos aos estereoisômeros E e Z do hexanal e heptanal. A seção final menciona que, após a determinação dos parâmetros ótimos, curvas de calibração serão obtidas e parâmetros de mérito (faixa linear, linearidade, precisão, exatidão, limites de detecção e quantificação) serão avaliados para a validação completa do método. A inovação da impregnação do DNPH na barra adsortiva e o novo design da haste são apontados como fatores contribuintes para a melhoria do método, mas também como responsáveis pelo aumento da densidade da barra, problema solucionado com o novo design da haste, o qual melhorou a sua flutuação e rotação na extração.

A impregnação inédita do derivatizante DNPH na barra adsortiva demonstrou-se eficaz no desenvolvimento do método, garantindo boa sensibilidade. No entanto, o aumento da densidade da barra adsortiva devido à impregnação resultou em um desempenho reduzido de flutuação e rotação da barra durante a extração. Este problema, que poderia comprometer a eficiência do método, foi resolvido com o remodelamento da técnica BAµE proposto no trabalho, utilizando uma nova haste de aço inoxidável que melhora a agitação e a adsorção dos analitos. A combinação da impregnação do derivatizante com a otimização da técnica de extração permitiu alcançar um nível de sensibilidade desejado para a detecção dos analitos.

O trabalho apresenta um remodelamento inédito para a técnica de BAµE, introduzindo uma haste de aço inoxidável com uma pequena volta na extremidade para suporte da barra adsortiva. Este novo design, que permite uma fixação da haste na tampa do frasco através de um orifício, melhora significativamente a eficiência da extração. A agitação magnética, realizada por uma barra magnética em formato de estrela, gera forte agitação e formação de bolhas acima da barra adsortiva (Figura 23, não apresentada aqui), otimizando a rotação da barra e, consequentemente, a adsorção dos analitos. A melhoria na eficiência da extração é fundamental para aumentar a sensibilidade do método e garantir resultados mais precisos na quantificação dos aldeídos.

Com o conhecimento dos parâmetros ótimos de derivatização, extração, dessorção e separação/detecção cromatográfica, o próximo passo é a obtenção de curvas de calibração na matriz para quantificação dos aldeídos em amostras reais de urina. A avaliação de parâmetros de mérito, como faixa linear de trabalho, linearidade, precisão, exatidão, e limites de detecção e quantificação, será realizada para a validação completa do método. A conclusão destaca a originalidade do método, que integra a técnica de BAµE com impregnação de derivatizante na barra adsortiva e o novo design da haste, inéditos na literatura até o momento. A expectativa é que os dados obtidos permitam a elaboração de um artigo científico para submissão em revistas da área.