Mapeamento de Tumores Mamários Caninos por Microdifração de Raios X

A pesquisa utiliza o modelo canino para estudos translacionais em câncer de mama humano devido à alta incidência de tumores espontâneos em cadelas, exposição a fatores ambientais similares e características de desenvolvimento da doença muito parecidas com as humanas. As alterações estruturais mapeadas em tumores caninos podem ser extrapoladas para o câncer humano, auxiliando no desenvolvimento de diagnósticos e tratamentos mais eficazes. O objetivo principal foi mapear as características estruturais de tecidos adjacentes a tumores mamários caninos benignos e malignos, usando a microdifração de raios X em ângulo médio para determinar a extensão das alterações estruturais. Cinco amostras foram analisadas: adenoma simples, adenoma policístico, carcinoma sólido e dois adenocarcinomas. As amostras foram conservadas em formalina e cobertas com filme Kapton durante as medições, sendo aplicados fatores de correção para atenuar a atenuação da própria amostra e contribuições espúrias. A análise por espalhamento de raios X em ângulo médio (WAXS) forneceu informações sobre a organização molecular dos tecidos, crucial para entender a infiltração tumoral. Resultados preliminares mostraram picos em q = 19.8 nm⁻¹ (tecido fibroglandular, associado à distância entre moléculas de água) e q = 13.8 nm⁻¹ (tecido adiposo, associado ao espaçamento de cadeias de ácidos graxos), demonstrando heterogeneidade tecidual. A liofilização das amostras, subsequente às medições, permitiu avaliar a influência da água no processo de espalhamento.

Estudos sobre câncer de mama canino são relevantes tanto para a medicina veterinária quanto para a oncologia humana. Diversos autores sugerem a cadela como modelo apropriado para pesquisas relacionadas ao câncer de mama humano, devido à alta incidência de tumores espontâneos, exposição a fatores ambientais semelhantes e características de desenvolvimento similares à doença em humanos (Pinho et al., 2012; Visan et al., 2016). As alterações estruturais observadas no mapeamento de tumores caninos podem ser estendidas ao câncer humano, servindo como uma poderosa ferramenta translacional. Este modelo permite o desenvolvimento de técnicas diagnósticas e terapêuticas eficazes, beneficiando tanto pacientes caninos quanto humanos (Pinho et al., 2012). A alta incidência de tumores espontâneos em cadelas (três vezes maior que em humanos, Owen, 1979) torna o estudo com estes animais preferível, também por questões éticas, substituindo práticas como a indução de tumores em camundongos (Gordon; Khanna, 2010). Similaridades genéticas entre o câncer de mama humano e canino também foram observadas, sugerindo grande similaridade interespécies na rede de circuitos de sinalização do câncer (Pinho et al., 2012; Uva et al., 2009). A etiologia hormonal, com receptores de estrogênio e progesterona presentes em lesões benignas e malignas, demonstra outra característica comum entre as duas espécies (Queiroga et al., 2011). A dependência hormonal em tumores mamários caninos e humanos é semelhante, impactando no prognóstico e tratamento.

O estudo utilizou amostras de tumores mamários caninos obtidas com aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais da UTFPR (protocolo 2017-029/2017) e fornecidas pelo Laboratório de Patologia Veterinária da UFPR - Campus Agrárias. Os laudos histopatológicos seguiram o consenso de Cassali et al. (2014), baseado na classificação de Misdorp et al. (1999). Foram analisadas cinco amostras: duas com lesões benignas (adenoma simples e policístico) e três com lesões malignas (carcinoma sólido e dois adenocarcinomas simples, grau I). As amostras, conservadas em formalina (solução de formol tamponado a 10%), foram cortadas com aproximadamente 2 mm de espessura e 1,5 cm² de área, incluindo partes do tumor e tecido normal adjacente. Cinco pontos foram selecionados em cada amostra para análise, utilizando o sistema laser-vídeo do equipamento. Após as medições, as amostras foram liofilizadas usando um Liofilizador L101 (Liotop, Brasil) para estudar a influência da água. Os experimentos foram conduzidos em um difratômetro D8 Discover (Bruker) do LORXI-UFPR, em modo reflexão. A distância fonte-amostra foi de 520 mm, e a distância amostra-detector variou (200 mm para amostras hidratadas e 135 mm para as liofilizadas). Amostras fixadas em formalina utilizaram porta-amostra com filme Kapton, enquanto as liofilizadas utilizaram porta-amostra com fundo de alumínio, cuja contribuição no espalhamento foi considerada na análise dos dados.

O estudo utilizou amostras de tumores mamários caninos obtidas do Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Paraná (UFPR), aprovadas pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UTFPR (protocolo 2017-029/2017). As amostras, provenientes de descartes de tumores mamários espontâneos da espécie Canis lupus familiaris, foram conservadas em formalina (solução de formol tamponado a 10%) em temperatura ambiente. A análise histopatológica seguiu o consenso de Cassali et al. (2014), baseado na classificação de Misdorp et al. (1999). Cinco amostras foram selecionadas, incluindo duas com lesões benignas (adenoma simples e policístico) e três com lesões malignas (um carcinoma sólido e dois adenocarcinomas simples, grau I). As amostras foram cortadas com aproximadamente 2 mm de espessura e 1,5 cm² de área, incluindo tecido tumoral e tecido normal adjacente. Em cada amostra, cinco pontos foram selecionados para análise com o auxílio do sistema laser-vídeo do equipamento, buscando abranger a região tumoral e os tecidos circundantes. Após a análise inicial das amostras em seu estado fixado em formalina, estas foram submetidas a um processo de liofilização utilizando o Liofilizador L101 (Liotop, Brasil), disponível no Departamento Acadêmico de Química e Biologia da UTFPR, para determinar o conteúdo hídrico e analisar a influência da água no espalhamento de raios X. O peso das amostras foi registrado antes e após a liofilização, e as amostras liofilizadas foram armazenadas em um compartimento plástico vedado a 5°C até o momento da análise.

A análise por microdifração de raios X foi realizada em um difratômetro D8 Discover (Bruker, Alemanha) pertencente ao Laboratório de Ótica de Raios X e Instrumentação (LORXI) da UFPR, em modo reflexão. A distância fonte-amostra foi de 520 mm. A distância amostra-detector variou: 200 mm para amostras hidratadas (fixadas em formalina) e 135 mm para amostras liofilizadas, visando reduzir o tempo de medida. As amostras fixadas em formalina foram cobertas com uma fina camada de filme Kapton durante a análise, enquanto as amostras liofilizadas utilizaram um porta-amostra diferente com fundo de alumínio. O tempo de exposição foi de 600 segundos por passo. O momentum transfer variou de 5.8 nm⁻¹ a 41.3 nm⁻¹ (com passos de 0.005º) para amostras em formalina e de 8.7 nm⁻¹ a 39.1 nm⁻¹ (com passos de 0.01º) para amostras liofilizadas. Foram aplicados fatores de correção relacionados à auto-atenuação da amostra e contribuições espúrias, como a do filme Kapton (nas amostras hidratadas) e do alumínio (nas amostras liofilizadas). O perfil de espalhamento do alumínio foi obtido separadamente para auxiliar na identificação de picos provenientes do porta-amostra nos perfis das amostras liofilizadas, uma vez que a variação na espessura das amostras após a liofilização impossibilitou a subtração generalizada da contribuição do alumínio. A normalização da intensidade permitiu comparar os perfis de espalhamento das amostras liofilizadas e hidratadas.

A microdifração de raios X revelou perfis de espalhamento distintos em diferentes regiões das amostras, demonstrando a heterogeneidade dos tecidos ao redor dos tumores mamários. Regiões de tecido fibroglandular apresentaram um pico principal em torno de q = 19,8 nm⁻¹, associado à distância entre moléculas de água vizinhas. Um pico menos intenso, em q = 30 nm⁻¹, foi observado em tecidos glandulares e adiposos, possivelmente relacionado à conexão de hidroxilas entre moléculas de água ou ao espalhamento harmônico do pico de ácidos graxos. Tecidos adiposos apresentaram um pico mais estreito em q = 13,8 nm⁻¹, correspondente ao espaçamento da cadeia de ácidos graxos. A análise comparativa entre pontos de uma mesma amostra evidenciou a grande variação nos perfis de espalhamento, confirmando a heterogeneidade tecidual ao redor do tumor. Após a liofilização, a redução da intensidade nas medidas variou de ponto para ponto, sendo proporcional à quantidade de tecido fibroglandular na região, indicando que a perda de água é maior em áreas ricas em tecido fibroglandular. A supressão do pico em q = 19,8 nm⁻¹ nas amostras liofilizadas confirmou sua relação com as moléculas de água.

A dissertação apresenta a análise detalhada de cinco amostras: um adenoma simples, um adenoma policístico, um carcinoma sólido e dois adenocarcinomas simples (grau I). Cada amostra teve seus cinco pontos analisados individualmente, descrevendo suas características e conteúdo hídrico após liofilização. A análise focou na identificação dos picos relacionados ao tecido adiposo (em torno de q = 13,9 nm⁻¹) e ao tecido fibroglandular (em torno de q = 19,8 nm⁻¹), além da avaliação da razão entre as intensidades desses picos (I₁/I₂). Foram observadas variações significativas nos perfis de espalhamento entre os diferentes pontos de uma mesma amostra, reforçando a heterogeneidade do tecido. Em amostras com maior componente fibroglandular, a perda de água após liofilização foi mais pronunciada, refletindo na supressão do pico em q = 19,8 nm⁻¹. Em alguns casos, a presença de picos adicionais foi discutida em relação à possível contribuição do porta-amostras (Kapton ou alumínio) e do rearranjo molecular após a liofilização. A amostra de carcinoma sólido apresentou perfis anômalos em alguns pontos, limitando a interpretação dos resultados para essas regiões específicas.

Os resultados obtidos foram comparados com um estudo previamente publicado por Conceição et al. (2019) para tecido mamário normal liofilizado. A comparação destacou diferenças entre os perfis de espalhamento, com a microdifração revelando picos (em q = 15,4 nm⁻¹ e 23,9 nm⁻¹) não observados na difração convencional, provavelmente devido à média de espalhamento em uma área maior. A supressão do pico em q = 19,8 nm⁻¹ nas amostras liofilizadas, em ambos os estudos, reforça a forte relação deste pico com as moléculas de água. A heterogeneidade observada nos perfis de espalhamento, mesmo em pontos muito próximos, justifica o uso da microdifração, que permite análise de regiões específicas, ao contrário da difração convencional, que fornece uma média da amostra inteira. A perda de conteúdo aquoso variou de 24,6% a 67,5% após liofilização, sendo mais pronunciada em regiões com maior tecido fibroglandular. O aparecimento de novos picos (q = 15,9 nm⁻¹ e 23,8 nm⁻¹) nas amostras liofilizadas sugere um rearranjo molecular durante o processo. Os resultados consolidam a microdifração como uma ferramenta eficaz para o mapeamento de tumores mamários caninos.

O estudo demonstra o potencial da microdifração de raios X para o mapeamento de tumores mamários caninos, fornecendo informações detalhadas sobre a organização molecular dos tecidos e a influência do conteúdo hídrico. A identificação de picos característicos em diferentes tecidos (adiposo e fibroglandular) e a observação da heterogeneidade tecidual ao redor dos tumores, mesmo em áreas próximas, são achados relevantes. A supressão do pico em q = 19,8 nm⁻¹ após a liofilização comprova a relação deste pico com a água presente no tecido fibroglandular. A similaridade entre as características histológicas do câncer de mama canino e humano, destacada na introdução, sugere que os resultados deste estudo podem ter implicações importantes para a pesquisa translacional em oncologia humana. A capacidade da técnica em identificar variações sutis na composição tecidual pode auxiliar no desenvolvimento de métodos de diagnóstico mais precisos e eficazes, contribuindo para um estadiamento mais preciso do tumor e a definição de um prognóstico mais adequado. Além disso, a compreensão da organização molecular dos tecidos pode auxiliar no desenvolvimento de novas terapias direcionadas, otimizando o tratamento e melhorando os resultados para pacientes tanto caninos quanto humanos.

Embora os resultados demonstrem o potencial da técnica, o estudo apresenta algumas limitações. O número de amostras analisadas foi relativamente pequeno, e a inclusão de um maior número de amostras, com diferentes tipos e estágios de tumores, permitiria uma análise estatística mais robusta. A variação na contribuição do porta-amostra (alumínio) nas amostras liofilizadas, devido à variação de espessura após a liofilização, afetou a análise em alguns pontos. Melhorias nos métodos de preparação da amostra e no controle das variáveis experimentais podem mitigar este problema. A observação de perfis anômalos em alguns pontos da amostra de carcinoma sólido reforça a necessidade de protocolos de análise mais robustos para garantir a confiabilidade dos dados. Futuras pesquisas devem se concentrar na ampliação da amostragem, na padronização dos procedimentos experimentais e na correlação dos dados obtidos por microdifração com outros parâmetros clínicos e histopatológicos, para melhor compreender a relação entre a organização molecular dos tecidos e o desenvolvimento e progressão do câncer de mama, tanto em cães quanto em humanos. A exploração de outras técnicas complementares pode enriquecer a análise e fornecer uma visão mais completa do tecido tumoral.